Wir danken Dr. J. Vergara (University of California, Los Angeles) für die Bereitstellung des EGFP-CaV1.1 (Kaninchen) Wildtyp-Plasmids. Wir danken dem Yale Department of Physiology Electronics Laboratory und insbesondere Henrik Abildgaard für das Design und den Bau der Fotodiode mit Track-and-Hold-Schaltung. Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse R01-AR075726 und R01-NS103777 der National Institutes of Health unterstützt.

Dieses Protokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Maryland genehmigt. Das folgende Protokoll wurde in mehrere Unterabschnitte unterteilt, bestehend aus (1) dem Design des molekularen Konstrukts und der Auswahl des Cystein-reagierenden Farbstoffs, (2) der In-vivo-Elektroporation , (3) der Muskeldissektion und Faserisolierung, (4) der Beschreibung des Erfassungsaufbaus, (5) der Bewertung der positiven elektrischen Faseraktivität des verstärkten grün fluoreszierenden Protei...

Funktionelle ortsgerichtete Fluorometrie in nativen Skelettmuskelzellen

Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Durchführung von FSDF in Muskelfasern zur Untersuchung einzelner Spannungssensorbewegungen aus dem CaV1.1-Kanal beschrieben. Auch wenn die Anzahl der Schritte und die Vielfalt der Ansätze, die in dieser Technik kombiniert werden, komplex erscheinen mögen, werden die meisten dieser Techniken oft routinemäßig in Labors von Biophysikern/Zellbiologen eingesetzt. Die scheinbare Komplexität liegt also hauptsächlich in der Kombination all der verschiedenen Ansä...

Die Fähigkeit, Konformationsänderungen von Ionenkanälen als Reaktion auf einen bekannten elektrischen Reiz in einer lebenden Zelle zu verfolgen, ist eine Quelle wertvoller Informationen für die molekulare Physiologie1. Spannungsabhängige Ionenkanäle sind Membranproteine, die Änderungen der Transmembranspannung wahrnehmen, und ihre Funktion wird auch durch Spannungsänderungen beeinflusst2. Die Entwicklung von Spannungszangentechniken im letzten Jahrhundert ermöglichte es Physiologen, Ionenströme, die von spannungsabhängigen Ionenkanälen als Reaktion auf die Membrandepolarisation übertragen werden, in Echtzeit zu untersuchen3. Der Einsatz der Voltage-Clamp-Technologie war entscheidend für das Verständnis der elektrischen Eigenschaften erregbarer Zellen wie Neuronen und Muskeln. In den 1970er Jahren ermöglichte die Verfeinerung der Spannungsklemme die Detektion von Gate-Strömen (oder Ladungsbewegungen) in spannungsabhängigen Kalzium- (Ca V) und Natrium- (NaV) Kanälen 4,5. Gating-Ströme sind nichtlineare kapazitive Ströme, die durch die Bewegung von Spannungssensoren als Reaktion auf Änderungen des elektrischen Feldes über die Zellmembran6 entstehen. Gating-Ströme werden als elektrische Manifestation molekularer Umlagerungen betrachtet, die der Ionenkanalöffnung7 vorausgehen oder diese begleiten. Während diese Strommessungen wertvolle Informationen über die Funktion des Kanals liefern, sind sowohl Ionenströme als auch Gating-Ströme indirekte Messwerte von inter- und intramolekularen Konformationsumlagerungen spannungsabhängiger Kanäle7.
Die funktionelle ortsgerichtete Fluorometrie (FSDF; auch als Voltage-Clamp-Fluorometrie bezeichnet, VCF) wurde in den frühen 1990er Jahren 8 entwickelt und ermöglichte es erstmals, lokale Konformationsänderungenund die Funktion eines Kanalproteins in Echtzeit direkt zu betrachten. Mit einer Kombination aus Kanalmutagenese, Elektrophysiologie und heterologen Expressionssystemen ist es möglich, die beweglichen Teile bestimmter Kanäle oder Rezeptoren als Reaktion auf den aktivierenden Stimulus fluoreszierend zu markieren und zu verfolgen 9,10. Dieser Ansatz wurde ausgiebig verwendet, um die Spannungsmessmechanismen in spannungsabhängigen Ionenkanälen 8,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 zu untersuchen. Maßgebliche Bewertungen finden Sie unter 10,20,21,22,23.
Die Ca-V- undNa-V-Kanäle, die für die Initiierung und Ausbreitung elektrischer Signale entscheidend sind, bestehen aus einerα1-Hauptuntereinheit, die eine zentrale Pore und vier nicht identische Spannungsmessdomänen2 besitzt. Zusätzlich zu ihrer ausgeprägten Primärstruktur werden Ca-V- und Na-V-Kanäle als Multi-Untereinheiten-Komplexe mit Hilfsuntereinheiten24 ausgedrückt. Spannungsabhängige Kaliumkanäle (K V) bestehen aus vier Untereinheiten, die wie eine einzelne Domäne von Na V oder CaV 25 aussehen. Die porenbildende und spannungsmessende α1-Untereinheit der Ca V- und NaV-Kanäle wird durch ein einzelnes Polypeptid gebildet, das für vier einzelne Domänen von sechs einzigartigen Transmembransegmenten kodiert (S1-S6; Abbildung 1A) 24,26. Der Bereich, der aus S1- bis S4-Transmembransegmenten besteht, bildet die Spannungssensordomäne (VSD) und die S5- und S6-Transmembransegmente bilden die Porendomäne26. In jedem VSD enthält die S4-α-Helix positiv geladenes Arginin oder Lysin (Abbildung 1A,B), die sich als Reaktion auf die Depolarisationder Membran bewegen 7. Mehrere Jahrzehnte Forschung und die Ergebnisse unterschiedlichster experimenteller Ansätze stützen die Annahme, dass sich S4-Segmente als Reaktion auf die Membrandepolarisation nach außen bewegen und Gating-Ströme erzeugen6.
FSDF misst die Fluoreszenzänderungen eines thiolreaktiven Farbstoffs, der an einen bestimmten Cysteinrest (d. h. die S4-α-Helix) auf einem Ionenkanal oder einem anderen Protein konjugiert ist, das durch gezielte Mutagenese erzeugt wird, da der Kanal als Reaktion auf Membrandepolarisation oder andere Reize funktioniert10. Tatsächlich wurde FSDF ursprünglich entwickelt, um zu untersuchen, ob sich das S4-Segment in KV-Kanälen, das als Hauptspannungssensor des Kanals vorgeschlagen wurde, bewegt, wenn sich die Anschnittladungen als Reaktion auf Änderungen des Membranpotentials 8,10 bewegen. Im Falle von spannungsabhängigen Ionenkanälen kann FSDF unabhängige Konformationsumlagerungen der vier VSDs (Verfolgung eines VSD zu einem bestimmten Zeitpunkt) gleichzeitig mit Kanalfunktionsmessungen auflösen. In der Tat wurde mit diesem Ansatz gezeigt, dass einzelne VSDs an bestimmten Aspekten der Kanalaktivierung und -inaktivierung unterschiedlich beteiligt zu sein scheinen 12,27,28,29,30. Die Identifizierung des Beitrags jedes VSD zur Funktion der Kanäle ist von hoher Relevanz und kann verwendet werden, um den Betrieb der Kanäle weiter aufzuklären und möglicherweise neue Ziele für die Arzneimittelentwicklung zu identifizieren.
Die Verwendung von FSDF in heterologen Expressionssystemen hat sich als äußerst hilfreich erwiesen, um unser Verständnis der Kanalfunktion aus einer reduktionistischen Perspektive zu erweitern10,23. Wie viele reduktionistische Ansätze bietet er Vorteile, hat aber auch Grenzen. Eine wesentliche Einschränkung ist beispielsweise die partielle Rekonstitution der Kanal-Nanoumgebung im heterologen System. Häufig interagieren Ionenkanäle mit zahlreichen akzessorischen Untereinheiten und zahlreichen anderen Proteinen, die ihre Funktion modifizieren31. Prinzipiell können verschiedene Kanäle und ihre akzessorischen Untereinheiten in heterologen Systemen unter Verwendung mehrerer proteinkodierender Konstrukte oder polycistronischer Plasmide exprimiert werden, aber ihre native Umgebung kann nicht vollständig rekonstituiert werden30,32.
Unsere Gruppe hat kürzlich eine Variante von FSDF in nativen dissoziierten Skelettmuskelfasern veröffentlicht, um frühe Schritte der Erregungs-Kontraktions-Kopplung (ECC) zu untersuchen33,34, den Prozess, durch den die elektrische Depolarisation von Muskelfasern mit der Aktivierung der Muskelkontraktion verbunden ist35,36. Dieser Ansatz ermöglichte zum ersten Mal die Bewegungsverfolgung einzelner S4-Spannungssensoren aus dem spannungsabhängigen L-Typ Ca2+ Kanal (CaV1.1, auch bekannt als DHPR) in der nativen Umgebung einer erwachsenen differenzierten Muskelfaser37. Dies wurde durch die Berücksichtigung mehrerer Eigenschaften dieses Zelltyps erreicht, einschließlich der elektrischen Aktivität der Zelle, die eine schnelle stimulationsinduzierte selbstpropagierende Depolarisation ermöglicht, der Fähigkeit, cDNA-Plasmide durch In-vivo-Elektroporation zu exprimieren, der natürlichen hohen Expression und Kompartimentorganisation der Kanäle innerhalb der Zelle und ihrer Kompatibilität mit Hochgeschwindigkeits-Bildgebungs- und elektrophysiologischen Aufzeichnungsgeräten. Früher haben wir ein konfokales Hochgeschwindigkeits-Zeilenrastermikroskop als Detektionsvorrichtung37 verwendet. Nun wird eine Variation der Technik vorgestellt, bei der eine Fotodiode zur Signalerfassung verwendet wird. Dieses auf Photodioden basierende Detektionssystem könnte die Implementierung dieser Technik in anderen Labors erleichtern.
Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Verwendung von FSDF in nativen Zellen für die Untersuchung der individuellen Bewegung von Spannungssensoren aus CaV1.1 beschrieben. Während der CaV1.1-Kanal in diesem Manuskript als Beispiel verwendet wurde, könnte diese Technik auf extrazellulär zugängliche Domänen anderer Ionenkanäle, Rezeptoren oder Oberflächenproteine angewendet werden.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>H3884-50mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>EP022363719-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z683531-100EA</td>
			<td>tuberculine slip tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/2&#8221; long 29-gauge sterile insulin needle and syringe</td>
			<td>Becton Dikinson</td>
			<td>324702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm non coated plastic plate</td>
			<td>Falcon, Corning</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm non coated plastic plate</td>
			<td>Falcon, Corning</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcoholic whip</td>
			<td>PDI</td>
			<td>B60307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-533 cube LP</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49907</td>
			<td>Ex: 530/30x; BS: 532; Em: 550lp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arc lamp</td>
			<td>Sutter Instrumets</td>
			<td>LB-LS 672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial tears cream</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-162-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass Pasteur pipet 5 3/4&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTS (N-benzyl-p-toluene sulphonamide)</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>203895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase type I</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>C0130-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWR-76048-960-BG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double electrode array&#160; (for electroporation)</td>
			<td>BTX harvard apparatus</td>
			<td>45-0120</td>
			<td>10mm 2 needle array tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>39002AT</td>
			<td>Ex: 480/30x; BS 505; Em: 535/40m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation apparatus device</td>
			<td>BTX harvard apparatus</td>
			<td>ECM 830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPC10</td>
			<td>HEKA Elektronik GmbH&#160; (Harvard Bioscience)</td>
			<td>895000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Biotechne,&#160; R&#38;D Systems</td>
			<td>RND-S11150H</td>
			<td>Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass coverslip 35 mm dish</td>
			<td>MatTek Life Science</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Fluriso (Isoflurane) Liquid for Inhalation</td>
			<td>502017-250ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothermal heating pad</td>
			<td>Braintree scientific inc</td>
			<td>39DP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>INV-23017015</td>
			<td>Laminin Mouse Protein, Natural</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex bulb</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82024-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED 530 nm</td>
			<td>Sutter Instrumets</td>
			<td>5A-530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low binding protein 0.2 &#956;m sterile filter</td>
			<td>Pall</td>
			<td>FG4579</td>
			<td>acrodisk&#160; syringe filter 0.2um supor membrane low protein binding non pyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>INV-11380037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS-5-TAMRA</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>89410-784</td>
			<td>MTS-5-TAMRA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro Analysis Software</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td>OriginPro 2022 (64-bit) SR1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlanApo 60x oil&#160; 1.4 N.A/&#8734;/0.17</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BFPC2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire 0.5 mm, 99.9 % metals basis</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>267228-1G</td>
			<td>To manufacyte field stimulation electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse Generator</td>
			<td>WPI</td>
			<td>Pulsemaster A300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shutter drive controller</td>
			<td>Uniblitz</td>
			<td>100-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shuttter</td>
			<td>Uniblitz</td>
			<td>VS2582T0-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S-MEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>INV-11380037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile bench pad</td>
			<td>VWR</td>
			<td>DSI-B1623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile saline</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>S8776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>1419447-1198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporizer for Anesthesia</td>
			<td>Parkland Scientific</td>
			<td>V3000PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltage generator</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional site-directed fluorometry in native cells to study skeletal muscle excitability

Die funktionelle ortsgerichtete Fluorometrie war die Technik der Wahl, um die Struktur-Funktions-Beziehung zahlreicher Membranproteine, einschließlich spannungsabhängiger Ionenkanäle, zu untersuchen. Dieser Ansatz wurde vor allem in heterologen Expressionssystemen verwendet, um gleichzeitig Membranströme, die elektrische Manifestation der Kanalaktivität und Fluoreszenzmessungen zu messen und lokale Domänenumlagerungen zu melden. Die funktionelle ortsgerichtete Fluorometrie kombiniert Elektrophysiologie, Molekularbiologie, Chemie und Fluoreszenz in einer einzigen, weitreichenden Technik, die es ermöglicht, strukturelle Umlagerungen und Funktionen durch Fluoreszenz bzw. Elektrophysiologie in Echtzeit zu untersuchen. In der Regel erfordert dieser Ansatz einen technisch hergestellten spannungsabhängigen Membrankanal, der ein Cystein enthält, das mit einem thiolreaktiven Fluoreszenzfarbstoff getestet werden kann. Bis vor kurzem wurde die Thiol-reaktive Chemie, die für die ortsgerichtete Fluoreszenzmarkierung von Proteinen verwendet wird, ausschließlich in Xenopus-Oozyten und Zelllinien durchgeführt, was den Anwendungsbereich des Ansatzes auf primäre, nicht erregbare Zellen einschränkte. Dieser Bericht beschreibt die Anwendbarkeit der funktionellen ortsgerichteten Fluorometrie in adulten Skelettmuskelzellen, um die frühen Schritte der Erregungs-Kontraktions-Kopplung zu untersuchen, den Prozess, durch den die elektrische Depolarisation von Muskelfasern mit der Aktivierung der Muskelkontraktion verbunden ist. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Methoden zum Design und zur Transfektion von Cystein-modifizierten spannungsabhängigen Ca2+ -Kanälen (CaV1.1) in Muskelfasern des Flexor digitorum brevis adulter Mäuse mittels in vivo Elektroporation und die nachfolgenden Schritte, die für funktionelle ortsgerichtete Fluorometriemessungen erforderlich sind. Dieser Ansatz kann angepasst werden, um andere Ionenkanäle und Proteine zu untersuchen. Der Einsatz der funktionellen ortsgerichteten Fluorometrie von Säugetiermuskeln ist besonders relevant für die Untersuchung grundlegender Mechanismen der Erregbarkeit.

The ability to track ion channel conformational rearrangements in response to a known electrical stimulus in a living cell is a source of valuable information for molecular physiology1. Voltage-gated ion channels are membrane proteins that sense changes in transmembrane voltage, and their function is also affected by voltage changes2. The development of voltage clamp techniques in the last century allowed physiologists to study, in real-time, ionic currents carried by voltage-gated ion channels in response to membrane depolarization3. The use of voltage clamp technology has been crucial in understanding the electrical properties of excitable cells such as neurons and muscle. In the 1970s, voltage clamp refinement allowed for the detection of gating currents (or charge movement) in voltage-gated calcium (CaV) and sodium (NaV) channels4,5. Gating currents are non-linear capacitive currents that arise from the movement of voltage sensors in response to changes in the electric field across the cell membrane6. Gating currents are considered an electrical manifestation of molecular rearrangements that precede or accompany ion channel opening7. While these current measurements provide valuable information regarding the channel&#39;s function, both ionic currents and gating currents are indirect readouts of inter- and intra-molecular conformational rearrangements of voltage-gated channels7.
Functional site-directed fluorometry (FSDF; also referred to as voltage clamp fluorometry, VCF) was developed in the early 1990s8 and, for the first time, provided the ability to directly view local conformational changes and the function of a channel protein in real time. Using a combination of channel mutagenesis, electrophysiology, and heterologous expression systems, it is possible to fluorescently tag and track the moving parts of specific channels or receptors in response to the activating stimulus9,10. This approach has been extensively used to study the voltage-sensing mechanisms in voltage-gated ion channels8,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. For authoritative reviews, see10,20,21,22,23.
The CaV and NaV channels, critical for the initiation and propagation of electrical signals, are composed of a main &#945;1 subunit, which possesses a central pore and four non-identical voltage sensing domains2. In addition to their distinct primary structure, CaV and NaV channels are expressed as multisubunit complexes with auxiliary subunits24. Voltage-dependent potassium channels (KV) consist of four subunits that look like a single domain of NaV or CaV25. The pore-forming and voltage-sensing &#945;1 subunit of CaV and NaV channels is formed by a single polypeptide coding for four individual domains of six unique transmembrane segments (S1-S6; Figure 1A)24,26. The region comprised by S1 to S4 transmembrane segments form the voltage sensing domain (VSD) and S5 and S6 transmembrane segments form the pore domain26. In each VSD, the S4 &#945;-helix contains positively charged arginine or lysine (Figure 1A,B) that move in response to membrane depolarization7. Several decades of research and the results from highly diverse experimental approaches support the premise that S4 segments move outward, generating gating currents, in response to membrane depolarization6.
FSDF measures the fluorescence changes of a thiol-reactive dye conjugated to a specific cysteine residue (i.e., the S4 &#945;-helix) on an ion channel or other protein, engineered via site-directed mutagenesis, as the channel functions in response to membrane depolarization or other stimuli10. In fact, FSDF was originally developed to investigate whether the S4 segment in KV channels, proposed to be the main voltage sensor of the channel, moves when the gating charges move in response to changes in membrane potential8,10. In case of voltage-gated ion channels, FSDF can resolve independent conformational rearrangements of the four VSDs (tracking one VSD at any given time), concurrently with channel function measurements. Indeed, using this approach, it has been shown that individual VSDs appear to be differentially involved in specific aspects of channel activation and inactivation12,27,28,29,30. Identifying the contribution of each VSD to the channels&#39; function is of high relevance and can be used to further elucidate channel operation and potentially identify new targets for drug development.
The use of FSDF in heterologous expression systems has been extremely helpful in furthering our understanding of channel function from a reductionist perspective10,23. Like many reductionist approaches, it presents advantages but also has limitations. For instance, one major limitation is the partial reconstitution of the channel nano environment in the heterologous system. Often, ion channels interact with numerous accessory subunits and numerous other proteins that modify their function31. In principle, different channels and their accessory subunits can be expressed in heterologous systems with the use of multiple protein coding constructs or polycistronic plasmids, but their native environment cannot be fully reconstituted30,32.
Our group recently published a variant of FSDF in native dissociated skeletal muscle fibers for the study of early steps of excitation-contraction coupling (ECC)33,34, the process by which muscle fiber electrical depolarization is linked to the activation of muscle contraction35,36. For the first time, this approach allowed the motion tracking of individual S4 voltage-sensors from the voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.1, also known as DHPR) in the native environment of an adult differentiated muscle fiber37. This was accomplished by considering multiple characteristics of this cell type, including the electrical activity of the cell allowing fast stimulation-induced self-propagated depolarization, the ability to express cDNA plasmid through in vivo electroporation, the natural high expression and compartmental organization of the channels within the cell, and its compatibility with high-speed imaging and electrophysiological recording devices. Previously, we used a high-speed line scanning confocal microscope as a detecting device37. Now, a variation of the technique is presented using a photodiode for signal acquisition. This photodiode-based detection system could facilitate the implementation of this technique in other laboratories.
Here, a step-by-step protocol to utilize FSDF in native cells for the study of individual voltage-sensor movement from CaV1.1 is described. While the CaV1.1 channel has been used as an example throughout this manuscript, this technique could be applied to extracellularly accessible domains of other ion channels, receptors, or surface proteins.

Autor im Rampenlicht: Funktionelle ortsgerichtete Fluorometrie in nativen Zellen zur Untersuchung der Erregbarkeit der Skelettmuskulatur  

Funktionelle ortsgerichtete Fluorometrie in nativen Zellen zur Untersuchung der Erregbarkeit der Skelettmuskulatur

CaV1.1, a member of the voltage-gated ion channels, has four distinct voltage sensors. Evidence suggests that some voltage sensors contribute more to ryanodine receptor activation or calcium current. We aim to be able to identify the precise role of each voltage sensor in excitation-contraction coupling and calcium channel activation.Excitation-contraction coupling has been studied since the early 50s, yet the molecular detail of how this process occur are still unknown. Recent advance in cyro-electron microscopic structure of the channel, the characterization of novel CaV1.1 accessory protein, the discovery of channel alternative splicing variant, and the identification of disease-causing mutation have reignited the interest in this field. Many techniques are used in our field, from classical electrophysiology and molecular biology to more novel techniques such as cryo-electron microscopy, molecular dynamic simulation, targeted protein degradation, and functional site-directed fluorometry as well as engineered cells or animal models.Currently, the fuel faces several experimental challenges. In a skeletal muscle, proper trafficking and communication between CaV1.1 and RyR1, along with many regulatory proteins, is crucial to support excitation-contraction coupling. The methods to directly study these protein-protein interactions between CaV1.1 and RyR1 are missing or incomplete.The laboratory of Dr.Martin Schneider has been working on excitation-contraction coupling for decades, characterizing voltage-sensing mechanisms in CaV1.1, calcium release, and localized calcium-release events, known as calcium sparks. Recently, our laboratory has been implementing new optical techniques to investigate various steps of excitation-contraction coupling and voltage sensor motion in functioning adult muscle cells. While this has been done previously in a heterologous expression system, our protocol now allows tracking conformational changes in CaV1.1 voltage sensors during a propagated action potential in his native environment.Our new technique will allow us to investigate the precise movement of the voltage sensor needed for excitation-contraction coupling. We want to know which charge residue in each S4 are critical for its function, or exactly each S4 translocate, and all that's translocation is linked to CaV1.1 opening or ryanodine receptor activation.

Wenn sich ausbreitende Aktionspotentiale als Reaktion auf eine sich wiederholende Feldstimulation ausgelöst werden, ist es möglich, eine bestimmte Spannungssensorbewegung als Reaktion auf eine bestimmte Depolarisationsfrequenz zu verfolgen. Wie in Abbildung 6A gezeigt, kann die Bewegung von VSD-II-markierten Helices als Reaktion auf zwei aufeinanderfolgende Depolarisationen verfolgt werden, die bei 10 Hz (d. h. im Abstand von 100 ms) angewendet werden. Die Signalbleichung kann korrigiert w...

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Die funktionelle ortsgerichtete Fluorometrie ist eine Methode zur Untersuchung von Proteindomänenbewegungen in Echtzeit. Die Modifikation dieser Technik für ihre Anwendung in nativen Zellen ermöglicht nun die Detektion und Verfolgung einzelner Spannungssensorbewegungen von spannungsabhängigen Ca2+ -Kanälen in murinen isolierten Skelettmuskelfasern.

Functional site-directed fluorometry has been the technique of choice to investigate the structure-function relationship of numerous membrane proteins, ...

CaV1.1, ein Mitglied der spannungsabhängigen Ionenkanäle, verfügt über vier verschiedene Spannungssensoren. Es gibt Hinweise darauf, dass einige Spannungssensoren mehr zur Aktivierung des Ryanodinrezeptors oder des Kalziumstroms beitragen. Unser Ziel ist es, die genaue Rolle jedes Spannungssensors bei der Anregungs-Kontraktions-Kopplung und der Aktivierung des Kalziumkanals zu identifizieren.Die Anregungs-Kontraktions-Kopplung wird seit den frühen 50er Jahren untersucht, doch die molekularen Details, wie dieser Prozess abläuft, sind noch unbekannt. Jüngste Fortschritte in der zyroelektronenmikroskopischen Struktur des Kanals, die Charakterisierung eines neuartigen CaV1.1-akzessorischen Proteins, die Entdeckung einer alternativen Spleißvariante des Kanals und die Identifizierung von krankheitsverursachenden Mutationen haben das Interesse an diesem Gebiet neu entfacht. In unserem Fachgebiet werden viele Techniken eingesetzt, von der klassischen Elektrophysiologie und Molekularbiologie bis hin zu neuartigeren Techniken wie Kryo-Elektronenmikroskopie, molekulardynamischer Simulation, gezieltem Proteinabbau und funktioneller ortsgerichteter Fluorometrie sowie gentechnisch veränderten Zellen oder Tiermodellen.Derzeit steht der Kraftstoff vor mehreren experimentellen Herausforderungen. In einem Skelettmuskel ist der ordnungsgemäße Transport und die Kommunikation zwischen CaV1.1 und RyR1 sowie vielen regulatorischen Proteinen entscheidend, um die Kopplung von Erregung und Kontraktion zu unterstützen. Die Methoden, um diese Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen CaV1.1 und RyR1 direkt zu untersuchen, fehlen oder sind unvollständig.Das Labor von Dr. Martin Schneider beschäftigt sich seit Jahrzehnten mit der Anregungs-Kontraktions-Kopplung und charakterisiert Spannungsmessmechanismen in CaV1.1, die Freisetzung von Kalzium und lokale Kalziumfreisetzungsereignisse, die als Kalziumfunken bekannt sind. In jüngster Zeit hat unser Labor neue optische Techniken implementiert, um verschiedene Schritte der Erregungs-Kontraktions-Kopplung und der Bewegung von Spannungssensoren in funktionierenden erwachsenen Muskelzellen zu untersuchen. Während dies bisher in einem heterologen Expressionssystem durchgeführt wurde, erlaubt unser Protokoll nun die Verfolgung von Konformationsänderungen in CaV1.1-Spannungssensoren während eines sich ausbreitenden Aktionspotentials in seiner natürlichen Umgebung.Unsere neue Technik wird es uns ermöglichen, die genaue Bewegung des Spannungssensors zu untersuchen, die für die Anregungs-Kontraktions-Kopplung benötigt wird. Wir wollen wissen, welche Ladungsreste in jedem S4 für seine Funktion entscheidend sind, oder genau jedes S4 translozieren, und all diese Translokation ist mit der Öffnung von CaV1.1 oder der Aktivierung des Ryanodinrezeptors verbunden.

Funktionelle ortsgerichtete Fluorometrie in nativen Zellen zur Untersuchung der Erregbarkeit der Skelettmuskulatur

Abstract