EGFP-CaV1.1(토끼) 야생형 플라스미드를 공유해 주신 J. Vergara 박사(University of California, Los Angeles)에게 감사드립니다. 트랙 앤 홀드 회로가 있는 포토다이오드의 설계 및 제작에 대해 Yale Department of Physiology Electronics Laboratory, 특히 Henrik Abildgaard에게 감사드립니다. 이 작업은 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 보조금 R01-AR075726 및 R01-NS103777의 지원을 받았다

이 프로토콜은 메릴랜드 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 다음 프로토콜은 (1) 분자 구조 설계 및 시스테인 반응 염료 선택, (2) 생체 내 전기천공, (3) 근육 해부 및 섬유 분리, (4) 획득 설정 설명, (5) 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP) 양성 섬유 전기 활성 및 시스테인 염색 평가, (6) 신호 획득 및 처리. 또한 각 섹션의 시작 부분에는 골격근 섬유에 FSDF를 적용할 때 몇 ?...

Native Skeletal Muscle Cells의 기능적 부위 지정 형광 측정법(Functional Site-Directed Fluorometry in native Skeletal Muscle Cells)

여기서, CaV1.1 채널에서 개별 전압 센서 운동의 연구를 위해 근섬유에서 FSDF를 수행하는 단계별 프로토콜이 설명됩니다. 이 기술에 결합된 단계의 수와 접근 방식의 다양성이 복잡해 보일 수 있지만 이러한 기술의 대부분은 종종 생물 물리학자/세포 생물학자 실험실에서 일상적으로 사용됩니다. 따라서 겉보기 복잡성은 주로 단일 통합 기술에서 모든 다양한 접근 방식의 조합에 있습니다. ...

살아있는 세포에서 알려진 전기적 자극에 대한 반응으로 이온 채널 구조적 재배열을 추적하는 능력은 분자 생리학에 대한 귀중한 정보의 원천입니다1. 전압 개폐 이온 채널은 막횡단 전압의 변화를 감지하는 막 단백질이며, 그 기능도 전압 변화의 영향을 받습니다2. 지난 세기의 전압 클램프 기술의 발전으로 생리학자들은 막 탈분극에 반응하여 전압 개폐 이온 채널에 의해 전달되는 이온 전류를 실시간으로 연구할 수 있었습니다3. 전압 클램프 기술의 사용은 뉴런 및 근육과 같은 흥분성 세포의 전기적 특성을 이해하는 데 중요했습니다. 1970년대에는 전압 클램프 미세 조정을 통해 전압 개폐 칼슘(CaV) 및 나트륨(NaV) 채널 4,5에서 게이팅 전류(또는 전하 이동)를 감지할 수 있었습니다. 게이팅 전류는 세포막6을 가로지르는 전기장의 변화에 반응하여 전압 센서의 움직임에서 발생하는 비선형 용량성 전류입니다. 게이팅 전류는 이온 채널 개방7 이전 또는 수반되는 분자 재배열의 전기적 표현으로 간주된다. 이러한 전류 측정은 채널의 기능에 관한 귀중한 정보를 제공하지만, 이온 전류와 게이팅 전류는 모두 전압 개폐 채널7의 분자 간 및 분자 내 구조적 재배열에 대한 간접적인 판독값입니다.
1990년대 초반에 개발된 기능적 부위 지정 형광 측정법(FSDF, Voltage Clamp Fluorometry, VCF라고도 함)은8 처음으로 국소 구조적 변화와 채널 단백질의 기능을 실시간으로 직접 볼 수 있는 기능을 제공했습니다. 채널 돌연변이 유발, 전기생리학 및 이종 발현 시스템의 조합을 사용하여, 활성화 자극에 반응하여 특정 채널 또는 수용체의 움직이는 부분을 형광으로 태깅하고 추적할 수 있다(9,10). 이 접근법은 전압 개폐 이온 채널 8,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19에서 전압 감지 메커니즘을 연구하기 위해 광범위하게 사용되었습니다. 권위 있는 리뷰는 10,20,21,22,23을 참조하십시오.
전기 신호의 개시 및 전파에 중요한 Ca V 및 NaV 채널은 중앙 기공과 4개의 동일하지 않은 전압 감지 도메인2을 가진 메인 α1 서브유닛으로 구성됩니다. 이들의 뚜렷한 1차 구조에 더하여, CaV 및NaV 채널은 보조 서브유닛(24)을 갖는 다중 서브유닛 복합체로서 표현된다. 전압 의존성 칼륨 채널(KV)은 NaV 또는CaV25의 단일 도메인처럼 보이는 4 개의 서브 유닛으로 구성됩니다. CaV 및NaV 채널의 기공 형성 및 전압 감지 α1 서브유닛은 6개의 고유한 막횡단 세그먼트의 4개의 개별 도메인을 암호화하는 단일 폴리펩티드에 의해 형성된다(S1-S6; 그림 1A) 24,26. S1 내지 S4 막횡단 세그먼트로 구성된 영역은 전압 감지 도메인(VSD)을 형성하고, S5 및 S6 막횡단 세그먼트는 공극 도메인(26)을 형성한다. 각 VSD에서 S4 α 나선에는 양전하를 띤 아르기닌 또는 라이신(그림 1A, B)이 포함되어 있으며, 이 아르기닌 또는 라이신은 멤브레인 탈분극에 반응하여 움직입니다7. 수십 년에 걸친 연구와 매우 다양한 실험적 접근 방식의 결과는 S4 세그먼트가 바깥쪽으로 이동하여 막 탈분극에 반응하여 게이팅 전류를 생성한다는 전제를 뒷받침합니다6.
FSDF는 막 탈분극 또는 다른 자극에 반응하여 채널이 기능함에 따라 부위 지정 돌연변이 유발을 통해 조작된 이온 채널 또는 기타 단백질의 특정 시스테인 잔기(즉, S4 α-나선)에 접합된 티올 반응성 염료의 형광 변화를 측정합니다10. 사실, FSDF는 원래 막전위 8,10의 변화에 반응하여 게이팅 전하가 이동할 때 채널의 주 전압 센서로 제안된 KV 채널의 S4 세그먼트가 이동하는지 여부를 조사하기 위해 개발되었습니다. 전압 개폐 이온 채널의 경우, FSDF는 채널 기능 측정과 동시에 4개의 VSD의 독립적인 구조적 재배열을 해결할 수 있습니다(주어진 시간에 하나의 VSD 추적). 실제로, 이러한 접근법을 사용하면, 개별적인 VSD가 채널 활성화 및 불활성화의 특정 양태에 차별적으로 관여하는 것으로 나타났다(12,27,28,29,30). 채널 기능에 대한 각 VSD의 기여도를 식별하는 것은 관련성이 높으며 채널 운영을 추가로 설명하고 잠재적으로 약물 개발을 위한 새로운 목표를 식별하는 데 사용할 수 있습니다.
이종 발현 시스템에서 FSDF의 사용은 환원주의적 관점에서 채널 기능에 대한 이해를 증진하는 데 매우 도움이 되었습니다10,23. 많은 환원주의적 접근 방식과 마찬가지로 장점이 있지만 한계도 있습니다. 예를 들어, 한 가지 주요 한계는 이종 시스템에서 채널 나노 환경의 부분적인 재구성입니다. 종종, 이온 채널은 수많은 부속 서브유닛 및 그 기능을 변형시키는 수많은 다른 단백질과 상호작용한다31. 원칙적으로, 상이한 채널 및 그들의 부속 서브유닛은 다수의 단백질 코딩 구축물 또는 폴리시스트로닉 플라스미드의 사용으로 이종 시스템에서 발현될 수 있지만, 이들의 본래 환경은 완전히 재구성될 수 없다30,32.
우리 그룹은 최근 근육 섬유의 전기 탈분극이 근육 수축의 활성화와 연결되는 과정인 여기-수축 커플링(ECC)33,34의 초기 단계를 연구하기 위해 천연 해리 골격근 섬유에서 FSDF의 변형을 발표했습니다35,36. 처음으로, 이 접근법은 성인 분화 근섬유의 본래 환경에서 전압-개폐 L형Ca2+ 채널(CaV1.1, DHPR로도 알려짐)로부터 개별적인 S4 전압-센서들의 모션 트래킹을 허용하였다37. 이는 빠른 자극 유도 자가 전파 탈분극을 허용하는 세포의 전기적 활성, 생체 내 전기천공을 통해 cDNA 플라스미드를 발현하는 능력, 세포 내 채널의 자연적인 높은 발현 및 구획 조직, 고속 이미징 및 전기생리학적 기록 장치와의 호환성을 포함하여 이 세포 유형의 여러 특성을 고려하여 달성되었습니다. 이전에는 고속 라인 주사 공초점 현미경을 검출 장치(37)로서 사용하였다. 이제 신호 수집을 위해 광 다이오드를 사용하여 기술의 변형이 제시됩니다. 이 포토다이오드 기반 검출 시스템은 다른 실험실에서 이 기술의 구현을 용이하게 할 수 있습니다.
여기에서는 CaV1.1에서 개별 전압 센서 이동을 연구하기 위해 천연 셀에서 FSDF를 활용하는 단계별 프로토콜이 설명되어 있습니다. CaV1.1 채널이 이 원고 전체에서 예로 사용되었지만 이 기술은 다른 이온 채널, 수용체 또는 표면 단백질의 세포 외 접근 가능한 도메인에 적용될 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>H3884-50mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>EP022363719-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z683531-100EA</td>
			<td>tuberculine slip tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/2&#8221; long 29-gauge sterile insulin needle and syringe</td>
			<td>Becton Dikinson</td>
			<td>324702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm non coated plastic plate</td>
			<td>Falcon, Corning</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm non coated plastic plate</td>
			<td>Falcon, Corning</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcoholic whip</td>
			<td>PDI</td>
			<td>B60307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-533 cube LP</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49907</td>
			<td>Ex: 530/30x; BS: 532; Em: 550lp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arc lamp</td>
			<td>Sutter Instrumets</td>
			<td>LB-LS 672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial tears cream</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-162-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass Pasteur pipet 5 3/4&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTS (N-benzyl-p-toluene sulphonamide)</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>203895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase type I</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>C0130-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWR-76048-960-BG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double electrode array&#160; (for electroporation)</td>
			<td>BTX harvard apparatus</td>
			<td>45-0120</td>
			<td>10mm 2 needle array tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>39002AT</td>
			<td>Ex: 480/30x; BS 505; Em: 535/40m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation apparatus device</td>
			<td>BTX harvard apparatus</td>
			<td>ECM 830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPC10</td>
			<td>HEKA Elektronik GmbH&#160; (Harvard Bioscience)</td>
			<td>895000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Biotechne,&#160; R&#38;D Systems</td>
			<td>RND-S11150H</td>
			<td>Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass coverslip 35 mm dish</td>
			<td>MatTek Life Science</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Fluriso (Isoflurane) Liquid for Inhalation</td>
			<td>502017-250ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothermal heating pad</td>
			<td>Braintree scientific inc</td>
			<td>39DP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>INV-23017015</td>
			<td>Laminin Mouse Protein, Natural</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex bulb</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82024-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED 530 nm</td>
			<td>Sutter Instrumets</td>
			<td>5A-530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low binding protein 0.2 &#956;m sterile filter</td>
			<td>Pall</td>
			<td>FG4579</td>
			<td>acrodisk&#160; syringe filter 0.2um supor membrane low protein binding non pyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>INV-11380037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS-5-TAMRA</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>89410-784</td>
			<td>MTS-5-TAMRA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro Analysis Software</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td>OriginPro 2022 (64-bit) SR1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlanApo 60x oil&#160; 1.4 N.A/&#8734;/0.17</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BFPC2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire 0.5 mm, 99.9 % metals basis</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>267228-1G</td>
			<td>To manufacyte field stimulation electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse Generator</td>
			<td>WPI</td>
			<td>Pulsemaster A300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shutter drive controller</td>
			<td>Uniblitz</td>
			<td>100-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shuttter</td>
			<td>Uniblitz</td>
			<td>VS2582T0-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S-MEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>INV-11380037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile bench pad</td>
			<td>VWR</td>
			<td>DSI-B1623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile saline</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>S8776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>1419447-1198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporizer for Anesthesia</td>
			<td>Parkland Scientific</td>
			<td>V3000PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltage generator</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional site-directed fluorometry in native cells to study skeletal muscle excitability

기능적 부위 지정 형광 측정법은 전압 개폐 이온 채널을 포함한 수많은 막 단백질의 구조-기능 관계를 조사하기 위해 선택되는 기술이었습니다. 이 접근법은 주로 이종 발현 시스템에서 멤브레인 전류, 채널 활동의 전기적 발현 및 형광 측정을 동시에 측정하여 로컬 도메인 재배열을 보고하는 데 사용되었습니다. 기능적 부위 지정 형광 측정법은 전기 생리학, 분자 생물학, 화학 및 형광을 형광 및 전기 생리학을 통해 실시간 구조 재배열 및 기능을 연구할 수 있는 광범위한 단일 기술로 결합합니다. 일반적으로 이 접근 방식에는 티올 반응성 형광 염료로 테스트할 수 있는 시스테인을 포함하는 엔지니어링된 전압 개폐 멤브레인 채널이 필요합니다. 최근까지 단백질의 부위 지향 형광 표지에 사용된 티올 반응성 화학은 Xenopus 난모세포 및 세포주에서만 수행되어 1차 비흥분성 세포에 대한 접근 범위를 제한했습니다. 이 보고서는 근육 섬유의 전기 탈분극이 근육 수축의 활성화와 연결되는 과정인 여기-수축 커플링의 초기 단계를 연구하기 위해 성인 골격근 세포에서 기능적 부위 지시 형광 측정법의 적용 가능성을 설명합니다. 본 프로토콜은 생체 내 전기천공을 사용하여 시스테인 공학 전압 개폐 Ca2+ 채널(CaV1.1)을 설계하고 성인 마우스의 굴근 손가락 브레비스의 근육 섬유로 형질감염시키는 방법론과 기능적 부위 지정 형광 측정 측정에 필요한 후속 단계를 설명합니다. 이 접근법은 다른 이온 채널과 단백질을 연구하는 데 적용할 수 있습니다. 포유류 근육의 기능적 부위 지정 형광 측정법의 사용은 특히 흥분성의 기본 메커니즘을 연구하는 것과 관련이 있습니다.

The ability to track ion channel conformational rearrangements in response to a known electrical stimulus in a living cell is a source of valuable information for molecular physiology1. Voltage-gated ion channels are membrane proteins that sense changes in transmembrane voltage, and their function is also affected by voltage changes2. The development of voltage clamp techniques in the last century allowed physiologists to study, in real-time, ionic currents carried by voltage-gated ion channels in response to membrane depolarization3. The use of voltage clamp technology has been crucial in understanding the electrical properties of excitable cells such as neurons and muscle. In the 1970s, voltage clamp refinement allowed for the detection of gating currents (or charge movement) in voltage-gated calcium (CaV) and sodium (NaV) channels4,5. Gating currents are non-linear capacitive currents that arise from the movement of voltage sensors in response to changes in the electric field across the cell membrane6. Gating currents are considered an electrical manifestation of molecular rearrangements that precede or accompany ion channel opening7. While these current measurements provide valuable information regarding the channel&#39;s function, both ionic currents and gating currents are indirect readouts of inter- and intra-molecular conformational rearrangements of voltage-gated channels7.
Functional site-directed fluorometry (FSDF; also referred to as voltage clamp fluorometry, VCF) was developed in the early 1990s8 and, for the first time, provided the ability to directly view local conformational changes and the function of a channel protein in real time. Using a combination of channel mutagenesis, electrophysiology, and heterologous expression systems, it is possible to fluorescently tag and track the moving parts of specific channels or receptors in response to the activating stimulus9,10. This approach has been extensively used to study the voltage-sensing mechanisms in voltage-gated ion channels8,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. For authoritative reviews, see10,20,21,22,23.
The CaV and NaV channels, critical for the initiation and propagation of electrical signals, are composed of a main &#945;1 subunit, which possesses a central pore and four non-identical voltage sensing domains2. In addition to their distinct primary structure, CaV and NaV channels are expressed as multisubunit complexes with auxiliary subunits24. Voltage-dependent potassium channels (KV) consist of four subunits that look like a single domain of NaV or CaV25. The pore-forming and voltage-sensing &#945;1 subunit of CaV and NaV channels is formed by a single polypeptide coding for four individual domains of six unique transmembrane segments (S1-S6; Figure 1A)24,26. The region comprised by S1 to S4 transmembrane segments form the voltage sensing domain (VSD) and S5 and S6 transmembrane segments form the pore domain26. In each VSD, the S4 &#945;-helix contains positively charged arginine or lysine (Figure 1A,B) that move in response to membrane depolarization7. Several decades of research and the results from highly diverse experimental approaches support the premise that S4 segments move outward, generating gating currents, in response to membrane depolarization6.
FSDF measures the fluorescence changes of a thiol-reactive dye conjugated to a specific cysteine residue (i.e., the S4 &#945;-helix) on an ion channel or other protein, engineered via site-directed mutagenesis, as the channel functions in response to membrane depolarization or other stimuli10. In fact, FSDF was originally developed to investigate whether the S4 segment in KV channels, proposed to be the main voltage sensor of the channel, moves when the gating charges move in response to changes in membrane potential8,10. In case of voltage-gated ion channels, FSDF can resolve independent conformational rearrangements of the four VSDs (tracking one VSD at any given time), concurrently with channel function measurements. Indeed, using this approach, it has been shown that individual VSDs appear to be differentially involved in specific aspects of channel activation and inactivation12,27,28,29,30. Identifying the contribution of each VSD to the channels&#39; function is of high relevance and can be used to further elucidate channel operation and potentially identify new targets for drug development.
The use of FSDF in heterologous expression systems has been extremely helpful in furthering our understanding of channel function from a reductionist perspective10,23. Like many reductionist approaches, it presents advantages but also has limitations. For instance, one major limitation is the partial reconstitution of the channel nano environment in the heterologous system. Often, ion channels interact with numerous accessory subunits and numerous other proteins that modify their function31. In principle, different channels and their accessory subunits can be expressed in heterologous systems with the use of multiple protein coding constructs or polycistronic plasmids, but their native environment cannot be fully reconstituted30,32.
Our group recently published a variant of FSDF in native dissociated skeletal muscle fibers for the study of early steps of excitation-contraction coupling (ECC)33,34, the process by which muscle fiber electrical depolarization is linked to the activation of muscle contraction35,36. For the first time, this approach allowed the motion tracking of individual S4 voltage-sensors from the voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.1, also known as DHPR) in the native environment of an adult differentiated muscle fiber37. This was accomplished by considering multiple characteristics of this cell type, including the electrical activity of the cell allowing fast stimulation-induced self-propagated depolarization, the ability to express cDNA plasmid through in vivo electroporation, the natural high expression and compartmental organization of the channels within the cell, and its compatibility with high-speed imaging and electrophysiological recording devices. Previously, we used a high-speed line scanning confocal microscope as a detecting device37. Now, a variation of the technique is presented using a photodiode for signal acquisition. This photodiode-based detection system could facilitate the implementation of this technique in other laboratories.
Here, a step-by-step protocol to utilize FSDF in native cells for the study of individual voltage-sensor movement from CaV1.1 is described. While the CaV1.1 channel has been used as an example throughout this manuscript, this technique could be applied to extracellularly accessible domains of other ion channels, receptors, or surface proteins.

저자 스포트라이트: 골격근 흥분성을 연구하기 위한 Native Cells의 기능적 부위 지정 형광 측정법  

골격근 흥분성을 연구하기 위한 천연 세포의 기능적 부위 지정 형광 측정

CaV1.1, a member of the voltage-gated ion channels, has four distinct voltage sensors. Evidence suggests that some voltage sensors contribute more to ryanodine receptor activation or calcium current. We aim to be able to identify the precise role of each voltage sensor in excitation-contraction coupling and calcium channel activation.Excitation-contraction coupling has been studied since the early 50s, yet the molecular detail of how this process occur are still unknown. Recent advance in cyro-electron microscopic structure of the channel, the characterization of novel CaV1.1 accessory protein, the discovery of channel alternative splicing variant, and the identification of disease-causing mutation have reignited the interest in this field. Many techniques are used in our field, from classical electrophysiology and molecular biology to more novel techniques such as cryo-electron microscopy, molecular dynamic simulation, targeted protein degradation, and functional site-directed fluorometry as well as engineered cells or animal models.Currently, the fuel faces several experimental challenges. In a skeletal muscle, proper trafficking and communication between CaV1.1 and RyR1, along with many regulatory proteins, is crucial to support excitation-contraction coupling. The methods to directly study these protein-protein interactions between CaV1.1 and RyR1 are missing or incomplete.The laboratory of Dr.Martin Schneider has been working on excitation-contraction coupling for decades, characterizing voltage-sensing mechanisms in CaV1.1, calcium release, and localized calcium-release events, known as calcium sparks. Recently, our laboratory has been implementing new optical techniques to investigate various steps of excitation-contraction coupling and voltage sensor motion in functioning adult muscle cells. While this has been done previously in a heterologous expression system, our protocol now allows tracking conformational changes in CaV1.1 voltage sensors during a propagated action potential in his native environment.Our new technique will allow us to investigate the precise movement of the voltage sensor needed for excitation-contraction coupling. We want to know which charge residue in each S4 are critical for its function, or exactly each S4 translocate, and all that's translocation is linked to CaV1.1 opening or ryanodine receptor activation.

반복적인 자기장 자극에 대한 응답으로 전파 활동 전위가 트리거되면 특정 주파수의 탈분극에 대한 응답으로 특정 전압 센서 동작을 추적할 수 있습니다. 도 6A에 도시된 바와 같이, VSD-II-태깅된 나선의 움직임은 10Hz(즉, 100ms만큼 이격된)에서 인가된 2개의 연속적인 탈분극 각각에 응답하여 추적될 수 있다. 신호 표백은 트레이스에서 기준선을 빼서 수정할 수 있습니다(<strong ...

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기능적 부위 지정 형광 측정법은 단백질 도메인 동작을 실시간으로 연구하는 방법입니다. 천연 세포에 적용하기 위해 이 기술을 수정하면 이제 쥐 격리 골격근 섬유의 전압 개폐 Ca2+ 채널에서 단일 전압 센서 동작을 감지하고 추적할 수 있습니다.

Functional site-directed fluorometry has been the technique of choice to investigate the structure-function relationship of numerous membrane proteins, ...

전압 개폐 이온 채널의 구성원인 CaV1.1에는 4개의 고유한 전압 센서가 있습니다. 증거에 따르면 일부 전압 센서는 리아노딘 수용체 활성화 또는 칼슘 전류에 더 많이 기여합니다. 우리는 여기-수축 커플링 및 칼슘 채널 활성화에서 각 전압 센서의 정확한 역할을 식별할 수 있는 것을 목표로 합니다.여기-수축 결합은 50년대 초반부터 연구되어 왔지만 이 과정이 어떻게 발생하는지에 대한 분자적 세부 사항은 아직 알려져 있지 않습니다. 채널의 사이로-전자 현미경 구조의 최근 발전, 새로운 CaV1.1 보조 단백질의 특성화, 채널 대체 스플라이싱 변이체의 발견 및 질병 유발 돌연변이의 식별이 이 분야에 대한 관심을 다시 불러일으켰습니다. 고전적인 전기 생리학 및 분자 생물학에서 초저온 전자 현미경, 분자 역학 시뮬레이션, 표적 단백질 분해, 기능적 부위 지정 형광 측정법, 조작된 세포 또는 동물 모델과 같은 보다 새로운 기술에 이르기까지 많은 기술이 우리 분야에서 사용됩니다.현재 연료는 몇 가지 실험적 과제에 직면 해 있습니다. 골격근에서 CaV1.1과 RyR1 사이의 적절한 트래피킹 및 통신은 많은 조절 단백질과 함께 여기-수축 결합을 지원하는 데 중요합니다. CaV1.1과 RyR1 사이의 이러한 단백질-단백질 상호작용을 직접 연구하는 방법은 누락되었거나 불완전합니다.마틴 슈나이더 박사(Dr.Martin Schneider)의 실험실은 수십 년 동안 여기-수축 커플링(excitation-contraction coupling)을 연구해 왔으며, CaV1.1의 전압 감지 메커니즘, 칼슘 방출 및 칼슘 스파크로 알려진 국부적인 칼슘 방출 이벤트를 특성화했습니다. 최근에, 우리 실험실은 기능하는 성인 근육 세포에서 여기-수축 커플 링 및 전압 센서 운동의 다양한 단계를 조사하기 위해 새로운 광학 기술을 구현하고 있습니다. 이것은 이전에 이종 발현 시스템에서 수행되었지만, 이제 우리의 프로토콜을 통해 CaV1.1 전압 센서의 구조적 변화를 그의 원래 환경에서 전파된 활동 전위 동안 추적할 수 있습니다.우리의 새로운 기술을 통해 여기-수축 커플링에 필요한 전압 센서의 정확한 움직임을 조사할 수 있습니다. 우리는 각 S4의 어떤 전하 잔류물이 그 기능에 중요한지, 또는 정확히 각 S4 전위가 CaV1.1 개방 또는 리아노딘 수용체 활성화와 연결되어 있는지 알고 싶습니다.

골격근 흥분성을 연구하기 위한 천연 세포의 기능적 부위 지정 형광 측정

Abstract