Funksjonell stedsrettet fluorometri i innfødte celler for å studere skjelettmuskulaturspenning

Funksjonell stedsrettet fluorometri har vært den valgte teknikken for å undersøke struktur-funksjonsforholdet til mange membranproteiner, inkludert spenningsstyrte ionkanaler. Denne tilnærmingen har primært blitt brukt i heterologe ekspresjonssystemer for samtidig måling av membranstrømmer, den elektriske manifestasjonen av kanalens aktivitet og fluorescensmålinger, og rapporterer lokale domeneomlegginger. Funksjonell stedsrettet fluorometri kombinerer elektrofysiologi, molekylærbiologi, kjemi og fluorescens i en enkelt omfattende teknikk som tillater studier av sanntids strukturelle omorganiseringer og funksjon gjennom henholdsvis fluorescens og elektrofysiologi. Vanligvis krever denne tilnærmingen en konstruert spenningsstyrt membrankanal som inneholder en cystein som kan testes av et tiolreaktivt fluorescerende fargestoff. Inntil nylig ble den tiolreaktive kjemien som ble brukt til stedsrettet fluorescerende merking av proteiner, utført utelukkende i Xenopus-oocytter og cellelinjer, noe som begrenser omfanget av tilnærmingen til primære ikke-eksitable celler. Denne rapporten beskriver anvendeligheten av funksjonell stedsrettet fluorometri i voksne skjelettmuskelceller for å studere de tidlige trinnene i eksitasjons-kontraksjonskobling, prosessen der muskelfiber elektrisk depolarisering er knyttet til aktivering av muskelkontraksjon. Denne protokollen beskriver metodene for å designe og transfeksjonere cysteinkonstruerte spenningsstyrte Ca²⁺ kanaler (Ca_V1.1) til muskelfibre i flexor digitorum brevis av voksne mus ved bruk av in vivo elektroporering og de påfølgende trinnene som kreves for funksjonelle stedsrettede fluorometrimålinger. Denne tilnærmingen kan tilpasses for å studere andre ionkanaler og proteiner. Bruken av funksjonell stedsrettet fluorometri av pattedyrsmuskel er spesielt relevant for å studere grunnleggende eksitabilitetsmekanismer.