Функциональная сайт-направленная флуорометрия в нативных клетках для изучения возбудимости скелетных мышц

Summary

Функциональная сайт-направленная флуорометрия — это метод изучения движений белковых доменов в режиме реального времени. Модификация этого метода для его применения в нативных клетках теперь позволяет обнаруживать и отслеживать движения одного датчика напряжения из потенциал-зависимых каналов Ca²⁺ в изолированных волокнах скелетных мышц мышей.

Abstract

Функциональная сайт-направленная флуорометрия была методом выбора для исследования взаимосвязи структуры и функции многочисленных мембранных белков, включая потенциал-зависимые ионные каналы. Этот подход использовался в основном в гетерологичных экспрессионных системах для одновременного измерения мембранных токов, электрического проявления активности каналов и измерений флуоресценции, сообщая о локальных доменных перестройках. Функциональная сайт-направленная флуорометрия объединяет электрофизиологию, молекулярную биологию, химию и флуоресценцию в единый широкомасштабный метод, который позволяет изучать структурные перестройки и функции в реальном времени посредством флуоресценции и электрофизиологии соответственно. Как правило, для этого подхода требуется спроектированный потенциал-зависимый мембранный канал, содержащий цистеин, который может быть протестирован тиол-реактивным флуоресцентным красителем. До недавнего времени тиол-реакционноспособная химия, используемая для сайт-направленного флуоресцентного мечения белков, проводилась исключительно в ооцитах и клеточных линиях Xenopus , что ограничивало сферу применения подхода первичными невозбудимыми клетками. В этом отчете описывается применимость функциональной сайт-направленной флуорометрии в клетках скелетных мышц взрослого человека для изучения ранних этапов связи возбуждения-сокращения, процесса, посредством которого электрическая деполяризация мышечных волокон связана с активацией мышечного сокращения. В настоящем протоколе описываются методики проектирования и трансфектирования цистеин-инженерных потенциал-зависимых каналов Ca²⁺ (Ca_V1.1) в мышечные волокна сгибателя пальцев взрослых мышей с использованием электропорации in vivo , а также последующие этапы, необходимые для функциональных сайт-направленных флуорометрических измерений. Этот подход может быть адаптирован для изучения других ионных каналов и белков. Использование функциональной сайт-направленной флюорометрии мышц млекопитающих особенно актуально для изучения основных механизмов возбудимости.

Introduction

Способность отслеживать конформационные перестройки ионных каналов в ответ на известный электрический стимул в живой клетке является источником ценной информации для молекулярной физиологии¹. Потенциал-зависимые ионные каналы представляют собой мембранные белки, которые ощущают изменения трансмембранного напряжения, и на их функцию также влияют изменения напряжения². Развитие методов зажима напряжения в прошлом веке позволило физиологам изучать в режиме реального времени ионные токи, переносимые потенциал-зависимыми ионными каналами в ответ на деполяризацию мембраны³. Использование технологии зажи....

Protocol

Этот протокол был одобрен Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Мэриленда. Следующий протокол был разделен на несколько подразделов, состоящих из (1) дизайна молекулярной конструкции и выбора красителя, реагирующего на цистеин, (2) электропо?.......

Discussion

Здесь описан пошаговый протокол проведения FSDF в мышечных волокнах для исследования движений отдельных датчиков напряжения от канала Ca_V1.1. Несмотря на то, что количество этапов и разнообразие подходов, которые сочетаются в этой технике, могут показаться сложными, большинство из э?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hyaluronidase	SIGMA ALDRICH	H3884-50mg
0.5 mL Eppendorf tube	Millipore Sigma	EP022363719-500EA
1 mL syringe	Millipore Sigma	Z683531-100EA	tuberculine slip tip
1/2” long 29-gauge sterile insulin needle and syringe	Becton Dikinson	324702
35 mm non coated plastic plate	Falcon, Corning	353001
60 mm non coated plastic plate	Falcon, Corning	351007
Alcoholic whip	PDI	B60307
Alexa-533 cube LP	Chroma	49907	Ex: 530/30x; BS: 532; Em: 550lp
Arc lamp	Sutter Instrumets	LB-LS 672
Artificial tears cream	Akorn	NDC 59399-162-35
Borosilicate glass Pasteur pipet 5 3/4"	VWR	14672-200
BTS (N-benzyl-p-toluene sulphonamide)	SIGMA ALDRICH	203895
collagenase type I	SIGMA ALDRICH	C0130-1g
Cotton tip	VWR	VWR-76048-960-BG
Double electrode array  (for electroporation)	BTX harvard apparatus	45-0120	10mm 2 needle array tips
EGFP cube	Chroma	39002AT	Ex: 480/30x; BS 505; Em: 535/40m
Electroporation apparatus device	BTX harvard apparatus	ECM 830
EPC10	HEKA Elektronik GmbH  (Harvard Bioscience)	895000
FBS	Biotechne,  R&D Systems	RND-S11150H	Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated
glass coverslip 35 mm dish	MatTek Life Science	P35G-1.5-14-C
Isoflurane	Fluriso (Isoflurane) Liquid for Inhalation	502017-250ml
Isothermal heating pad	Braintree scientific inc	39DP
Laminin	Thermo Fisher	INV-23017015	Laminin Mouse Protein, Natural
Latex bulb	VWR	82024-554
LED 530 nm	Sutter Instrumets	5A-530
Low binding protein 0.2 μm sterile filter	Pall	FG4579	acrodisk  syringe filter 0.2um supor membrane low protein binding non pyrogenic
MEM	Invitrogen	INV-11380037
MTS-5-TAMRA	Biotium	89410-784	MTS-5-TAMRA
OriginPro Analysis Software	OriginLab Corporation	OriginPro 2022 (64-bit) SR1
Photodiode	Custom Made	NA
PlanApo 60x oil  1.4 N.A/∞/0.17	Olympus	BFPC2
Platinum wire 0.5 mm, 99.9 % metals basis	SIGMA	267228-1G	To manufacyte field stimulation electrode
Pulse Generator	WPI	Pulsemaster A300
Shutter drive controller	Uniblitz	100-2B
Shuttter	Uniblitz	VS2582T0-100
S-MEM	Invitrogen	INV-11380037
Sterile bench pad	VWR	DSI-B1623
Sterile saline	SIGMA ALDRICH	S8776
Sylgard 184 Silicone Elastomer kit	Dow Corning	1419447-1198
Vaporizer for Anesthesia	Parkland Scientific	V3000PK
Voltage generator	Custom Made	NA