A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Функциональная сайт-направленная флуорометрия — это метод изучения движений белковых доменов в режиме реального времени. Модификация этого метода для его применения в нативных клетках теперь позволяет обнаруживать и отслеживать движения одного датчика напряжения из потенциал-зависимых каналов Ca2+ в изолированных волокнах скелетных мышц мышей.
Функциональная сайт-направленная флуорометрия была методом выбора для исследования взаимосвязи структуры и функции многочисленных мембранных белков, включая потенциал-зависимые ионные каналы. Этот подход использовался в основном в гетерологичных экспрессионных системах для одновременного измерения мембранных токов, электрического проявления активности каналов и измерений флуоресценции, сообщая о локальных доменных перестройках. Функциональная сайт-направленная флуорометрия объединяет электрофизиологию, молекулярную биологию, химию и флуоресценцию в единый широкомасштабный метод, который позволяет изучать структурные перестройки и функции в реальном времени посредством флуоресценции и электрофизиологии соответственно. Как правило, для этого подхода требуется спроектированный потенциал-зависимый мембранный канал, содержащий цистеин, который может быть протестирован тиол-реактивным флуоресцентным красителем. До недавнего времени тиол-реакционноспособная химия, используемая для сайт-направленного флуоресцентного мечения белков, проводилась исключительно в ооцитах и клеточных линиях Xenopus , что ограничивало сферу применения подхода первичными невозбудимыми клетками. В этом отчете описывается применимость функциональной сайт-направленной флуорометрии в клетках скелетных мышц взрослого человека для изучения ранних этапов связи возбуждения-сокращения, процесса, посредством которого электрическая деполяризация мышечных волокон связана с активацией мышечного сокращения. В настоящем протоколе описываются методики проектирования и трансфектирования цистеин-инженерных потенциал-зависимых каналов Ca2+ (CaV1.1) в мышечные волокна сгибателя пальцев взрослых мышей с использованием электропорации in vivo , а также последующие этапы, необходимые для функциональных сайт-направленных флуорометрических измерений. Этот подход может быть адаптирован для изучения других ионных каналов и белков. Использование функциональной сайт-направленной флюорометрии мышц млекопитающих особенно актуально для изучения основных механизмов возбудимости.
Способность отслеживать конформационные перестройки ионных каналов в ответ на известный электрический стимул в живой клетке является источником ценной информации для молекулярной физиологии1. Потенциал-зависимые ионные каналы представляют собой мембранные белки, которые ощущают изменения трансмембранного напряжения, и на их функцию также влияют изменения напряжения2. Развитие методов зажима напряжения в прошлом веке позволило физиологам изучать в режиме реального времени ионные токи, переносимые потенциал-зависимыми ионными каналами в ответ на деполяризацию мембраны3. Использование технологии зажи....
Этот протокол был одобрен Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Мэриленда. Следующий протокол был разделен на несколько подразделов, состоящих из (1) дизайна молекулярной конструкции и выбора красителя, реагирующего на цистеин, (2) электропо?.......
Когда распространяющиеся потенциалы действия срабатывают в ответ на повторяющуюся стимуляцию поля, можно отслеживать определенное движение датчика напряжения в ответ на определенную частоту деполяризации. Как показано на рисунке 6A, движение спиралей, помеченных VSD-II,.......
Здесь описан пошаговый протокол проведения FSDF в мышечных волокнах для исследования движений отдельных датчиков напряжения от канала CaV1.1. Несмотря на то, что количество этапов и разнообразие подходов, которые сочетаются в этой технике, могут показаться сложными, большинство из э?.......
Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов.
Мы благодарим доктора Джей Вергару (Калифорнийский университет, Лос-Анджелес) за то, что он поделился плазмидой дикого типа EGFP-CaV1.1 (кролик). Мы благодарим лабораторию электроники Йельского факультета физиологии и особенно Хенрика Абильдгаарда за проектирование и создание фотодиода с дорожкой и цепью удержания. Эта работа была поддержана грантами Национального института здравоохранения R01-AR075726 и R01-NS103777
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Hyaluronidase | SIGMA ALDRICH | H3884-50mg | |
0.5 mL Eppendorf tube | Millipore Sigma | EP022363719-500EA | |
1 mL syringe | Millipore Sigma | Z683531-100EA | tuberculine slip tip |
1/2” long 29-gauge sterile insulin needle and syringe | Becton Dikinson | 324702 | |
35 mm non coated plastic plate | Falcon, Corning | 353001 | |
60 mm non coated plastic plate | Falcon, Corning | 351007 | |
Alcoholic whip | PDI | B60307 | |
Alexa-533 cube LP | Chroma | 49907 | Ex: 530/30x; BS: 532; Em: 550lp |
Arc lamp | Sutter Instrumets | LB-LS 672 | |
Artificial tears cream | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
Borosilicate glass Pasteur pipet 5 3/4" | VWR | 14672-200 | |
BTS (N-benzyl-p-toluene sulphonamide) | SIGMA ALDRICH | 203895 | |
collagenase type I | SIGMA ALDRICH | C0130-1g | |
Cotton tip | VWR | VWR-76048-960-BG | |
Double electrode array (for electroporation) | BTX harvard apparatus | 45-0120 | 10mm 2 needle array tips |
EGFP cube | Chroma | 39002AT | Ex: 480/30x; BS 505; Em: 535/40m |
Electroporation apparatus device | BTX harvard apparatus | ECM 830 | |
EPC10 | HEKA Elektronik GmbH (Harvard Bioscience) | 895000 | |
FBS | Biotechne, R&D Systems | RND-S11150H | Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated |
glass coverslip 35 mm dish | MatTek Life Science | P35G-1.5-14-C | |
Isoflurane | Fluriso (Isoflurane) Liquid for Inhalation | 502017-250ml | |
Isothermal heating pad | Braintree scientific inc | 39DP | |
Laminin | Thermo Fisher | INV-23017015 | Laminin Mouse Protein, Natural |
Latex bulb | VWR | 82024-554 | |
LED 530 nm | Sutter Instrumets | 5A-530 | |
Low binding protein 0.2 μm sterile filter | Pall | FG4579 | acrodisk syringe filter 0.2um supor membrane low protein binding non pyrogenic |
MEM | Invitrogen | INV-11380037 | |
MTS-5-TAMRA | Biotium | 89410-784 | MTS-5-TAMRA |
OriginPro Analysis Software | OriginLab Corporation | OriginPro 2022 (64-bit) SR1 | |
Photodiode | Custom Made | NA | |
PlanApo 60x oil 1.4 N.A/∞/0.17 | Olympus | BFPC2 | |
Platinum wire 0.5 mm, 99.9 % metals basis | SIGMA | 267228-1G | To manufacyte field stimulation electrode |
Pulse Generator | WPI | Pulsemaster A300 | |
Shutter drive controller | Uniblitz | 100-2B | |
Shuttter | Uniblitz | VS2582T0-100 | |
S-MEM | Invitrogen | INV-11380037 | |
Sterile bench pad | VWR | DSI-B1623 | |
Sterile saline | SIGMA ALDRICH | S8776 | |
Sylgard 184 Silicone Elastomer kit | Dow Corning | 1419447-1198 | |
Vaporizer for Anesthesia | Parkland Scientific | V3000PK | |
Voltage generator | Custom Made | NA |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved