A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Abstract
Biology
İşlevsel bölgeye yönelik florometri, voltaj kapılı iyon kanalları da dahil olmak üzere çok sayıda membran proteininin yapı-fonksiyon ilişkisini araştırmak için tercih edilen teknik olmuştur. Bu yaklaşım öncelikle heterolog ekspresyon sistemlerinde, membran akımlarını, kanalların aktivitesinin elektriksel tezahürünü ve floresan ölçümlerini eşzamanlı olarak ölçmek ve yerel alan yeniden düzenlemelerini raporlamak için kullanılmıştır. İşlevsel sahaya yönelik florometri, elektrofizyoloji, moleküler biyoloji, kimya ve floresanı, sırasıyla floresan ve elektrofizyoloji yoluyla gerçek zamanlı yapısal yeniden düzenlemelerin ve fonksiyonların incelenmesine izin veren tek bir geniş kapsamlı teknikte birleştirir. Tipik olarak, bu yaklaşım, bir tiol-reaktif floresan boya ile test edilebilen bir sistein içeren mühendislik voltaj kapılı bir membran kanalı gerektirir. Yakın zamana kadar, proteinlerin bölgeye yönelik floresan etiketlemesi için kullanılan tiol-reaktif kimya, yalnızca Xenopus oositlerinde ve hücre hatlarında gerçekleştirildi ve birincil uyarılamayan hücrelere yaklaşımın kapsamını kısıtladı. Bu raporda, yetişkin iskelet kası hücrelerinde fonksiyonel bölgeye yönelik florometrinin, kas lifi elektriksel depolarizasyonunun kas kasılmasının aktivasyonu ile bağlantılı olduğu süreç olan uyarılma-kasılma eşleşmesinin erken adımlarını incelemek için uygulanabilirliği açıklanmaktadır. Bu protokol, in vivo elektroporasyon kullanarak yetişkin farelerin fleksör digitorum brevis'inin kas liflerine sistein mühendisliği ile tasarlanmış voltaj kapılı Ca2+ kanallarını (CaV1.1) tasarlamak ve transfekte etmek için metodolojileri ve fonksiyonel bölgeye yönelik florometri ölçümleri için gerekli sonraki adımları açıklamaktadır. Bu yaklaşım diğer iyon kanallarını ve proteinleri incelemek için uyarlanabilir. Memeli kasının fonksiyonel bölgeye yönelik florometrisinin kullanımı, uyarılabilirliğin temel mekanizmalarını incelemek için özellikle önemlidir.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved