עיכוב אופטוגנטי של התכווצות אקטומיוזין בתיווך Rho1 יחד עם מדידת מתח אפיתל בעוברי דרוזופילה

Summary

התכווצות אקטומיוזין ממלאת תפקיד חשוב במורפוגנזה של תאים ורקמות. עם זאת, זה מאתגר לתפעל התכווצות actomyosin in vivo בחריפות. פרוטוקול זה מתאר מערכת אופטוגנטית המעכבת במהירות את התכווצות האקטומיוזין בתיווך Rho1 בעוברי דרוזופילה , וחושפת את האובדן המיידי של מתח אפיתל לאחר השבתת אקטומיוזין in vivo.

Abstract

כוחות התכווצות הנוצרים על ידי אקטין ומיוזין שאינו שריר II ("התכווצות אקטומיוזין") הם קריטיים לשינויים מורפולוגיים של תאים ורקמות בסקאלות אורך מרובות, כגון חלוקת תאים, נדידת תאים, קיפול אפיתל ומורפוגנזה מסתעפת. הבנה מעמיקה של תפקיד התכווצות האקטומיוזין במורפוגנזה דורשת גישות המאפשרות השבתה מהירה של אקטומיוזין, דבר שקשה להשיג באמצעות גישות גנטיות או פרמקולוגיות קונבנציונליות. הפרוטוקול המוצג מדגים את השימוש במערכת דימריזציה אופטוגנטית מבוססת CRY2-CIBN, Opto-Rho1DN, כדי לעכב התכווצות אקטומיוזין בעוברי דרוזופילה עם בקרות זמניות ומרחביות מדויקות. במערכת זו, CRY2 מאוחה לצורה השלילית הדומיננטית של Rho1 (Rho1DN), בעוד CIBN מעוגן לקרום הפלזמה. דימריזציה בתיווך אור כחול של CRY2 ו-CIBN גורמת לטרנסלוקציה מהירה של Rho1DN מהציטופלסמה לקרום הפלזמה, שם הוא משבית אקטומיוזין על ידי עיכוב Rho1 אנדוגני. בנוסף, מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לצימוד אי-הפעלה בתיווך Opto-Rho1DN של אקטומיוזין עם אבלציה בלייזר כדי לחקור את תפקידו של אקטומיוזין ביצירת מתח אפיתל במהלך היווצרות תלמים גחונים של דרוזופילה . פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על תהליכים מורפולוגיים רבים אחרים הכוללים התכווצות אקטומיוזין בעוברי דרוזופילה עם שינויים מינימליים. בסך הכל, כלי אופטוגנטי זה הוא גישה רבת עוצמה לנתח את הפונקציה של התכווצות אקטומיוזין בשליטה על מכניקת רקמות במהלך עיצוב מחדש דינמי של רקמות.

Introduction

התכווצות אקטומיוזין, כוח ההתכווצות המופעל על ידי מיוזין שאינו שריר II (להלן "מיוזין") ברשת F-actin, הוא אחד הכוחות החשובים ביותר בשינוי צורת התא ובהנעת מורפוגנזה^ברמת הרקמה ^1,2. לדוגמה, הפעלת התכווצות אקטומיוזין בתחום האפי של תאי האפיתל גורמת להתכווצות אפיקלית, המאפשרת מגוון תהליכים מורפוגנטיים, כולל קיפול אפיתל, שחול תאים, דלמינציה וריפוי פצעים 3,4,5,6,7 . הפעלת מיוזין דורשת זרחן של שרשרת האור הרגולטורית שלו. שינוי זה מקל על הקונפורמציה המעכבת של מו....

Protocol

1. הגדרת הצלב הגנטי והכנת איסוף הביציות

1. נקבות זבובים נבחרות (בתולות) מהקו האופטוגנטי UASp-CIBNpm (I); UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) על כרית CO₂ תחת סטריאומיקרוסקופ והציב צלב עם זבובים זכרים מקו הנהג האימהי GAL4 67 Sqh-mCherry; 15 E-cadherin-GFP.
   הערה: 67 ו-15 מייצגים טובולין-GAL4 אימהי המוכנס לכרומוזומים השני (I.......

Discussion

פרוטוקול זה תיאר את השימוש המשולב באופטוגנטיקה ובאבלציה בלייזר כדי לבחון שינויים במתח הרקמה מיד לאחר השבתת התכווצות האקטומיוזין. הכלי האופטוגנטי המתואר כאן מנצל את הצורה השלילית הדומיננטית של Rho1 (Rho1DN) כדי לעכב בחריפות את התכווצות האקטומיוזין האנדוגנית Rho1 והתלויה ב-Rho1. אפיון קודם של Opto-Rho1.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm glass-bottom dish	MatTek	P35G-1.5-10-C	Used for sample preparation
60 mm × 15 mm Petri dish with lid	Falcon	351007	Used for sample preparation
Black cloth for covering the microscope	Online	NA	Used to avoid unwanted light stimulation
Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite)	VWR	10028-048	Used for embryo dechorination
CO2 pad	Genesee Scientific	59-114	Used for cross set-up
ddH2O	NA	NA	Used for sample preparation
Dumont Style 5 tweezers	VWR	102091-654	Used for sample preparation
Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2)	VWR	22940-834	Used for sample preparation
FluoView (Software)	Olympus	NA	Used for image acquisition and optogenetic stimulation
Halocarbon oil 27	Sigma Aldrich	H8773-100ML	Used for embryo stage visualization
ImageJ/FIJI	NIH	NA	Used for image analysis
MATLAB	MathWorks	NA	Used for image analysis
Nikon SMZ-745 stereoscope	Nikon	NA	Used for sample preparation
Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light.	Olympus	NA	Used for image acquisition and optogenetic stimulation
SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer)	VWR	30621-392	Used to avoid unwanted light stimulation
UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield)	Bolioptics	FM14036151	Used to avoid unwanted light stimulation
VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights	Amazon	NA	Used to avoid unwanted light stimulation