A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
התכווצות אקטומיוזין ממלאת תפקיד חשוב במורפוגנזה של תאים ורקמות. עם זאת, זה מאתגר לתפעל התכווצות actomyosin in vivo בחריפות. פרוטוקול זה מתאר מערכת אופטוגנטית המעכבת במהירות את התכווצות האקטומיוזין בתיווך Rho1 בעוברי דרוזופילה , וחושפת את האובדן המיידי של מתח אפיתל לאחר השבתת אקטומיוזין in vivo.
כוחות התכווצות הנוצרים על ידי אקטין ומיוזין שאינו שריר II ("התכווצות אקטומיוזין") הם קריטיים לשינויים מורפולוגיים של תאים ורקמות בסקאלות אורך מרובות, כגון חלוקת תאים, נדידת תאים, קיפול אפיתל ומורפוגנזה מסתעפת. הבנה מעמיקה של תפקיד התכווצות האקטומיוזין במורפוגנזה דורשת גישות המאפשרות השבתה מהירה של אקטומיוזין, דבר שקשה להשיג באמצעות גישות גנטיות או פרמקולוגיות קונבנציונליות. הפרוטוקול המוצג מדגים את השימוש במערכת דימריזציה אופטוגנטית מבוססת CRY2-CIBN, Opto-Rho1DN, כדי לעכב התכווצות אקטומיוזין בעוברי דרוזופילה עם בקרות זמניות ומרחביות מדויקות. במערכת זו, CRY2 מאוחה לצורה השלילית הדומיננטית של Rho1 (Rho1DN), בעוד CIBN מעוגן לקרום הפלזמה. דימריזציה בתיווך אור כחול של CRY2 ו-CIBN גורמת לטרנסלוקציה מהירה של Rho1DN מהציטופלסמה לקרום הפלזמה, שם הוא משבית אקטומיוזין על ידי עיכוב Rho1 אנדוגני. בנוסף, מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לצימוד אי-הפעלה בתיווך Opto-Rho1DN של אקטומיוזין עם אבלציה בלייזר כדי לחקור את תפקידו של אקטומיוזין ביצירת מתח אפיתל במהלך היווצרות תלמים גחונים של דרוזופילה . פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על תהליכים מורפולוגיים רבים אחרים הכוללים התכווצות אקטומיוזין בעוברי דרוזופילה עם שינויים מינימליים. בסך הכל, כלי אופטוגנטי זה הוא גישה רבת עוצמה לנתח את הפונקציה של התכווצות אקטומיוזין בשליטה על מכניקת רקמות במהלך עיצוב מחדש דינמי של רקמות.
התכווצות אקטומיוזין, כוח ההתכווצות המופעל על ידי מיוזין שאינו שריר II (להלן "מיוזין") ברשת F-actin, הוא אחד הכוחות החשובים ביותר בשינוי צורת התא ובהנעת מורפוגנזהברמת הרקמה 1,2. לדוגמה, הפעלת התכווצות אקטומיוזין בתחום האפי של תאי האפיתל גורמת להתכווצות אפיקלית, המאפשרת מגוון תהליכים מורפוגנטיים, כולל קיפול אפיתל, שחול תאים, דלמינציה וריפוי פצעים 3,4,5,6,7 . הפעלת מיוזין דורשת זרחן של שרשרת האור הרגולטורית שלו. שינוי זה מקל על הקונפורמציה המעכבת של מו....
1. הגדרת הצלב הגנטי והכנת איסוף הביציות
בעוברים לא מגורים שעברו כיווץ אפיקלי, Sqh-mCherry הועשר באזור הבינוני של התאים המזודרמליים הגחונים, בעוד ש-CRY2-Rho1DN-mCherry היה ציטוסולי (איור 1A). אבלציה בלייזר בתחום ההתכווצות הובילה לרתיעה מהירה של רקמות לאורך ציר A-P (איור 1B,C). בעוברים המגורים, האות CRY2-Rho1DN-mCher.......
פרוטוקול זה תיאר את השימוש המשולב באופטוגנטיקה ובאבלציה בלייזר כדי לבחון שינויים במתח הרקמה מיד לאחר השבתת התכווצות האקטומיוזין. הכלי האופטוגנטי המתואר כאן מנצל את הצורה השלילית הדומיננטית של Rho1 (Rho1DN) כדי לעכב בחריפות את התכווצות האקטומיוזין האנדוגנית Rho1 והתלויה ב-Rho1. אפיון קודם של Opto-Rho1.......
המחברים מודים לאן לבנוויי על תמיכתה בהדמיה. המחברים מודים למעבדת וישאוס ולמעבדת דה רנזיס על שיתוף ריאגנטים ולמרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה למניות זבובים. מחקר זה נתמך על ידי NIGMS ESI-MIRA R35GM128745 ומענק מחקר מוסדי של האגודה האמריקאית לסרטן #IRG-82-003-33 ל- BH.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
35 mm glass-bottom dish | MatTek | P35G-1.5-10-C | Used for sample preparation |
60 mm × 15 mm Petri dish with lid | Falcon | 351007 | Used for sample preparation |
Black cloth for covering the microscope | Online | NA | Used to avoid unwanted light stimulation |
Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite) | VWR | 10028-048 | Used for embryo dechorination |
CO2 pad | Genesee Scientific | 59-114 | Used for cross set-up |
ddH2O | NA | NA | Used for sample preparation |
Dumont Style 5 tweezers | VWR | 102091-654 | Used for sample preparation |
Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2) | VWR | 22940-834 | Used for sample preparation |
FluoView (Software) | Olympus | NA | Used for image acquisition and optogenetic stimulation |
Halocarbon oil 27 | Sigma Aldrich | H8773-100ML | Used for embryo stage visualization |
ImageJ/FIJI | NIH | NA | Used for image analysis |
MATLAB | MathWorks | NA | Used for image analysis |
Nikon SMZ-745 stereoscope | Nikon | NA | Used for sample preparation |
Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light. | Olympus | NA | Used for image acquisition and optogenetic stimulation |
SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer) | VWR | 30621-392 | Used to avoid unwanted light stimulation |
UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield) | Bolioptics | FM14036151 | Used to avoid unwanted light stimulation |
VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights | Amazon | NA | Used to avoid unwanted light stimulation |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved