Optogenetisk hemming av rho1-mediert aktomyosinkontraktilitet kombinert med måling av epitelspenning i Drosophila-embryoer

Kontraktile krefter generert av aktin og ikke-muskelmyosin II ("actomyosinkontraktilitet") er kritiske for morfologiske endringer av celler og vev på flere lengdeskalaer, slik som celledeling, cellemigrasjon, epitelfolding og forgreningsmorfogenese. En grundig forståelse av rollen som aktomyosinkontraktilitet i morfogenese krever tilnærminger som tillater rask inaktivering av aktomyosin, noe som er vanskelig å oppnå ved bruk av konvensjonelle genetiske eller farmakologiske tilnærminger. Den presenterte protokollen demonstrerer bruken av et CRY2-CIBN-basert optogenetisk dimeriseringssystem, Opto-Rho1DN, for å hemme actomyosinkontraktilitet i Drosophila-embryoer med presise tidsmessige og romlige kontroller. I dette systemet er CRY2 smeltet sammen med den dominerende negative formen av Rho1 (Rho1DN), mens CIBN er forankret til plasmamembranen. Blålysmediert dimerisering av CRY2 og CIBN resulterer i rask translokasjon av Rho1DN fra cytoplasma til plasmamembranen, hvor den inaktiverer actomyosin ved å hemme endogen Rho1. I tillegg presenterer denne artikkelen en detaljert protokoll for kobling av Opto-Rho1DN-mediert inaktivering av aktomyosin med laserablasjon for å undersøke rollen til aktomyosin i generering av epitelspenning under Drosophila ventralfuredannelse. Denne protokollen kan brukes på mange andre morfologiske prosesser som involverer aktomyosinkontraktilitet i Drosophila-embryoer med minimale modifikasjoner. Samlet sett er dette optogenetiske verktøyet en kraftig tilnærming til å dissekere funksjonen av aktomyosinkontraktilitet ved å kontrollere vevsmekanikk under dynamisk vevsremodellering.