Författarna tackar Ann Lavanway för stöd för bildbehandling. Författarna tackar Wieschaus-laboratoriet och De Renzis-laboratoriet för att de delar reagenser och Bloomington Drosophila Stock Center för flugbestånd. Denna studie stöds av NIGMS ESI-MIRA R35GM128745 och American Cancer Society Institutional Research Grant #IRG-82-003-33 till BH.

1. Ställa in det genetiska korset och förbereda ägguppsamlingskoppen
<ol><li>Välj honflugor (jungfruliga) från den optogenetiska linjen UASp-CIBNpm (I); UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) på en CO2 pad under ett stereomikroskop och sätt upp en korsning med hanflugor från moderns GAL4 driver line 67 Sqh-mCherry; 15 E-cadherin-GFP. OBS: 67 och 15 står för maternal-Tubulin-GAL4 insatt i den andra (II) respektive tredje (III) kromosomen,52. GAL4-linjen som använ...

Optogenetisk hämning av rho1-medierad aktomyosinkontraktilitet hos drosophila

Detta protokoll beskrev den kombinerade användningen av optogenetik och laserablation för att undersöka förändringar i vävnadsspänning omedelbart efter inaktivering av aktomyosinkontraktilitet. Det optogenetiska verktyget som beskrivs här drar fördel av den dominanta negativa formen av Rho1 (Rho1DN) för att akut hämma endogent Rho1 och Rho1-beroende aktomyosinkontraktilitet. Tidigare karakterisering av Opto-Rho1DN i samband med bildning av Drosophila ventrala fåror visade att verktyget är mycket eff...

Actomyosinkontraktilitet, den sammandragande kraft som utövas av icke-muskelmyosin II (hädanefter myosin) på F-aktinnätverket, är en av de viktigaste krafterna för att ändra cellform och driva morfogenes på vävnadsnivå 1,2. Till exempel resulterar aktiveringen av aktomyosinkontraktilitet vid epitelcellernas apikala domän i apikal sammandragning, vilket underlättar en mängd olika morfogenetiska processer, inklusive epitelveckning, cellextrudering, delaminering och sårläkning 3,4,5,6,7 . Aktiveringen av myosin kräver fosforylering av dess regulatoriska ljuskedja. Denna modifiering lindrar den hämmande konformationen av myosinmolekylerna, vilket gör att de kan bilda bipolära myosinfilamentbuntar med flera huvuddomäner i båda ändar. De bipolära myosinfilamenten driver den antiparallella rörelsen av aktinfilament och resulterar i generering av kontraktil kraft 1,8,9.
Den evolutionärt bevarade Rho-familjens små GTPas RhoA (Rho1 hos Drosophila) spelar en central roll i aktiveringen av aktomyosinkontraktilitet i olika cellulära sammanhang10,11. Rho1 fungerar som en bimolekylär omkopplare genom att binda antingen GTP (aktiv form) eller GDP (inaktiv form)12. Cyklingen mellan GTP- eller GDP-bundet Rho1 regleras av dess GTPasaktiverande proteiner (GAPs) och guaninnukleotidutbytesfaktorer (GEFs)13. GEFs funktion är att underlätta utbytet av BNP mot GTP och på så sätt aktivera Rho1-aktiviteten. GAPs, å andra sidan, förbättrar GTPas-aktiviteten hos Rho1 och inaktiverar därmed Rho1. Aktiverad Rho1 främjar aktomyosinkontraktilitet genom att interagera med och aktivera dess nedströms effektorer, Rho-associerat kinas (Rok) och Diaphanous14. Rok inducerar myosinaktivering och aktomyosinkontraktilitet genom fosforylering av den regulatoriska lätta kedjan av myosin15. Dessutom hämmar Rok också myosinregulatoriskt lättkedjigt fosfatas och främjar därmed ytterligare myosinfilamentmontering16. Rok kan också fosforylera LIM-kinaser, som, när de aktiveras, förhindrar aktindemontering genom att fosforylera och hämma aktin-depolymerisationsfaktorn cofilin17,18. Diaphanous är en forminfamilj aktinkärnbildare som främjar aktinpolymerisation, vilket ger en bas för myosin att interagera med 19,20,21.
Även om de cellulära mekanismerna som aktiverar aktomyosinkontraktilitet har klarlagts väl, är vår förståelse av dess funktion för att reglera dynamisk vävnadsremodellering fortfarande ofullständig. För att fylla denna kunskapslucka krävs metoder som snabbt kan inaktivera aktomyosin i specifika vävnadsregioner in vivo och registrera den omedelbara effekten på vävnadens beteende och egenskaper. Detta protokoll beskriver användningen av ett optogenetiskt tillvägagångssätt för att akut hämma aktomyosinkontraktilitet under Drosophila mesoderm-invagination, följt av mätning av epitelspänning med hjälp av laserablation. Under Drosophila-gastrulation genomgår de ventralt lokaliserade mesodermprekursorcellerna apikal sammandragning och invaginaterar från embryots yta genom att bilda en främre-posteriort orienterad fåra22,23. Bildandet av ventrala fåror har länge använts som modell för att studera mekanismen för epitelveckning. Bildandet av ventrala fåror administreras av det dorsal-ventrala mönstringssystemet hos Drosophila24,25,26,27. Uttrycket av två transkriptionsfaktorer, Twist och Snigel, som ligger på den ventrala sidan av embryot, styr bildandet av ventrala fåror och specificerar mesodermala cellers öde28. Twist and Snail aktiverar rekryteringen av Rho1 GEF RhoGEF2 till toppen av mesodermprekursorcellerna via en G-proteinkopplad receptorväg och ett RhoGEF2-adapterprotein, T48 29,30,31,32,33. Därefter aktiverar RhoGEF2 myosin i hela den apikala ytan av den potentiella mesodermen genom Rho-Rho-kinasvägen 34,35,36,37,38,39. Aktiverad myosin bildar ett supracellulärt aktomyosinnätverk genom hela den apikala ytan av mesoderm primordium, vars sammandragningar driver apikal sammandragning och resulterar i en snabb ökning av apikal vävnadsspänning 14,37,40.
Det optogenetiska verktyget som beskrivs i detta protokoll, Opto-Rho1DN, hämmar aktomyosinkontraktilitet genom blåljusberoende plasmamembranrekrytering av en dominant negativ form av Rho1 (Rho1DN)41. En T19N-mutation i Rho1DN eliminerar det muterade proteinets förmåga att utbyta GDP mot GTP och gör därmed proteinet ständigtinaktivt. En efterföljande mutation i Rho1DN, C189Y, eliminerar dess naiva membranmålsignal42,43. När Rho1DN infunderas till plasmamembranet binder det till och uppdämmer Rho1 GEFs, vilket blockerar aktiveringen av Rho1 samt Rho1-medierad aktivering av myosin och aktin34,44. Plasmamembranrekryteringen av Rho1DN uppnås genom en ljusberoende dimeriseringsmodul härledd från Cryptochrome 2 och dess bindningspartner CIB1. Kryptokrom 2 är en blåljusaktiverad kryptokromfotoreceptor i Arabidopsis thaliana45. Kryptokrom 2 binder till CIB1, ett basiskt helix-loop-helix-protein, endast i sitt fotoexciterade tillstånd45. Det visade sig senare att den bevarade N-terminalen, fotolyashimologiregionen (PHR), från kryptokrom 2 (CRY2PHR, hädanefter kallad CRY2) och den N-terminala domänen (aa 1-170) av CIB1 (hädanefter CIBN) är viktiga för ljusinducerad dimerisering46. Opto-Rho1DN innehåller två komponenter. Den första komponenten är CIBN-proteinet sammansmält med ett CAAX-ankare, som lokaliserar proteinet till plasmamembranet47. Den andra komponenten är mCherry-märkt CRY2 smält med Rho1DN41. I frånvaro av blått ljus stannar CRY2-Rho1DN kvar i cytoplasman. Vid stimulering av blått ljus riktas CRY2-Rho1DN mot plasmamembranet genom interaktionen mellan membranförankrad CIBN och exciterad CRY2. Opto-Rho1DN kan aktiveras av ultraviolett A (UVA) ljus och blått ljus (400-500 nm, toppaktivering vid 450-488 nm), eller av en 830-980 nm pulsad laser vid utförande av tvåfotonstimulering41,46,47,48. Därför stimuleras Opto-Rho1DN av våglängder som normalt används för exciterande GFP (488 nm för enfotonavbildning och 920 nm för tvåfotonavbildning). Våglängder som vanligtvis används för exciterande mCherry (561 nm för enkelfotonavbildning och 1 040 nm för tvåfotonavbildning) stimulerar däremot inte den optogenetiska modulen och kan därför användas för prestimuleringsavbildning. Protokollet beskriver de tillvägagångssätt som används för att minimera risken för oönskad stimulering under provmanipulation.
Laserablation har använts i stor utsträckning för att upptäcka och mäta spänningar i celler och vävnader49. Tidigare studier har visat att, när laserintensiteten kontrolleras på lämpligt sätt, kan tvåfotonlaserablation med användning av en femtosekunds nära-infraröd laser fysiskt försämra vissa subcellulära strukturer (t.ex. kortikala aktomyosinnätverk) utan att orsaka plasmamembranrapture50,51. Om vävnaden är under spänning resulterar laserablation av ett intresseområde i vävnaden i en omedelbar utåtriktad rekyl av cellerna intill det ablerade området. Rekylhastigheten är en funktion av storleken på spänningen och viskositeten hos mediet (cytoplasman) som omger strukturerna som genomgår rekyl49. På grund av det överlägsna penetrationsdjupet hos de nära-infraröda lasrarna och förmågan att uppnå väl begränsad fokal ablation, är tvåfotonlaserablation särskilt användbar för att detektera vävnadsspänning in vivo. Som demonstrerats i detta protokoll kan denna metod enkelt kombineras med Opto-Rho1DN-medierad inaktivering av aktomyosinkontraktilitet för att undersöka den direkta effekten av Rho1-beroende cellulär kontraktilitet på vävnadsmekanik under dynamisk vävnadsremodellering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm glass-bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td>Used for sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm &#215; 15 mm Petri dish with lid</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td>Used for sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black cloth for covering the microscope</td>
			<td>Online</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to avoid unwanted light stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10028-048</td>
			<td>Used for embryo dechorination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 pad</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-114</td>
			<td>Used for cross set-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Style 5 tweezers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102091-654</td>
			<td>Used for sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22940-834</td>
			<td>Used for sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoView (Software)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for image acquisition and optogenetic stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H8773-100ML</td>
			<td>Used for embryo stage visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/FIJI</td>
			<td>NIH</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon SMZ-745 stereoscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light.</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for image acquisition and optogenetic stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30621-392</td>
			<td>Used to avoid unwanted light stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield)</td>
			<td>Bolioptics</td>
			<td>FM14036151</td>
			<td>Used to avoid unwanted light stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to avoid unwanted light stimulation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic inhibition of rho1-mediated actomyosin contractility coupled with measurement of epithelial tension in drosophila embryos

Kontraktila krafter som genereras av aktin och icke-muskelmyosin II ("aktomyosinkontraktilitet") är avgörande för morfologiska förändringar av celler och vävnader på flera längdskalor, såsom celldelning, cellmigration, epitelveckning och förgrenad morfogenes. En djupgående förståelse av aktomyosinkontraktilitetens roll i morfogenesen kräver metoder som möjliggör snabb inaktivering av aktomyosin, vilket är svårt att uppnå med konventionella genetiska eller farmakologiska metoder. Det presenterade protokollet demonstrerar användningen av ett CRY2-CIBN-baserat optogenetiskt dimeriseringssystem, Opto-Rho1DN, för att hämma aktomyosinkontraktilitet i Drosophila-embryon med exakta tidsmässiga och rumsliga kontroller. I detta system är CRY2 sammansmält med den dominerande negativa formen av Rho1 (Rho1DN), medan CIBN är förankrat i plasmamembranet. Blåljusmedierad dimerisering av CRY2 och CIBN resulterar i snabb translokation av Rho1DN från cytoplasman till plasmamembranet, där det inaktiverar aktomyosin genom att hämma endogent Rho1. Dessutom presenterar denna artikel ett detaljerat protokoll för koppling av Opto-Rho1DN-medierad inaktivering av aktomyosin med laserablation för att undersöka aktomyosinets roll i att generera epitelspänning under bildning av Drosophila ventrala fåror. Detta protokoll kan tillämpas på många andra morfologiska processer som involverar aktomyosinkontraktilitet i Drosophila-embryon med minimala modifieringar. Sammantaget är detta optogenetiska verktyg ett kraftfullt tillvägagångssätt för att dissekera funktionen av aktomyosinkontraktilitet för att kontrollera vävnadsmekanik under dynamisk vävnadsremodellering.

Actomyosin contractility, the contractile force exerted by non-muscle myosin II (hereafter &#39;myosin&#39;) on the F-actin network, is one of the most important forces in changing cell shape and driving tissue-level morphogenesis1,2. For example, the activation of actomyosin contractility at the apical domain of the epithelial cells results in apical constriction, which facilitates a variety of morphogenetic processes, including epithelial folding, cell extrusion, delamination, and wound healing3,4,5,6,7. The activation of myosin requires phosphorylation of its regulatory light chain. This modification alleviates the inhibitory conformation of the myosin molecules, allowing them to form bipolar myosin filament bundles with multiple head domains on both ends. The bipolar myosin filaments drive the anti-parallel movement of actin filaments and result in the generation of contractile force1,8,9.
The evolutionarily conserved Rho family&#160;small GTPase RhoA (Rho1 in Drosophila)&#160;plays a central role in the activation of actomyosin contractility in various cellular contexts10,11. Rho1 functions as a bimolecular switch by binding either GTP (active form) or GDP (inactive form)12. The cycling between GTP- or GDP-bound Rho1 is regulated by its GTPase-activating proteins (GAPs) and guanine nucleotide-exchange factors (GEFs)13. GEFs function to facilitate the exchange of GDP for GTP and thus activate Rho1 activity. GAPs, on the other hand, enhance the GTPase activity of Rho1 and thus deactivate Rho1. Activated Rho1 promotes actomyosin contractility through interacting with and activating its downstream effectors, Rho-associated kinase (Rok) and Diaphanous14. Rok induces myosin activation and actomyosin contractility by phosphorylating the regulatory light chain of myosin15. In addition, Rok also inhibits the myosin regulatory light chain phosphatase, and hence further promotes myosin filament assembly16. Rok can also phosphorylate LIM kinases, which, when activated, prevent actin disassembly by phosphorylating and inhibiting the actin-depolymerization factor cofilin17,18. Diaphanous is a formin family actin nucleator that promotes actin polymerization, providing a base for myosin to interact with19,20,21.
While the cellular mechanisms that activate actomyosin contractility have been well elucidated, our understanding of its function in regulating dynamic tissue remodeling remains incomplete. Filling this knowledge gap requires approaches that can rapidly inactivate actomyosin at specific tissue regions in vivo and record the immediate impact on tissue behavior and properties. This protocol describes the use of an optogenetic approach to acutely inhibit actomyosin contractility during Drosophila mesoderm invagination, followed by measurement of epithelial tension using laser ablation. During Drosophila gastrulation, the ventrally localized mesoderm precursor cells undergo apical constriction and invaginate from the surface of the embryo by forming an anterior-posteriorly oriented furrow22,23. The formation of ventral furrows has long been used as a model for studying the mechanism of epithelial folding. Ventral furrow formation is administered by the dorsal-ventral patterning system in Drosophila24,25,26,27. The expression of two transcription factors, Twist and Snail, located at the ventral side of the embryo, controls ventral furrow formation and specifies mesodermal cell fate28. Twist and Snail activate the recruitment of the Rho1 GEF RhoGEF2 to the apex of the mesoderm precursor cells via a G-protein coupled receptor pathway and a RhoGEF2 adaptor protein, T4829,30,31,32,33. Next, RhoGEF2 activates myosin throughout the apical surface of the potential mesoderm through the Rho-Rho kinase pathway34,35,36,37,38,39. Activated myosin forms a supracellular actomyosin network throughout the apical surface of the mesoderm primordium, the contractions of which drive apical constriction and result in a rapid increase in apical tissue tension14,37,40.
The optogenetic tool described in this protocol, Opto-Rho1DN, inhibits actomyosin contractility through blue-light dependent plasma membrane recruitment of a dominant negative form of Rho1 (Rho1DN)41. A T19N mutation in Rho1DN eliminates the ability of the mutant protein to exchange GDP for GTP and thus renders the protein perpetually inactive34. A subsequent mutation in Rho1DN, C189Y, eliminates its naive membrane targeting signal42,43. When Rho1DN is infused to the plasma membrane, it binds to and impounds Rho1 GEFs, thereby blocking the activation of Rho1 as well as Rho1-mediated activation of myosin and actin34,44. The plasma membrane recruitment of Rho1DN is achieved through a light-dependent dimerization module derived from Cryptochrome 2 and its binding partner CIB1. Cryptochrome 2 is a blue-light activated Cryptochrome photoreceptor in Arabidopsis thaliana45. Cryptochrome 2 binds to CIB1, a basic helix-loop-helix protein, only in its photoexcited state45. It was later found that the conserved N-terminal, photolyase homology region (PHR), from Cryptochrome 2 (CRY2PHR, hereafter referred to as CRY2) and the N-terminal domain (aa 1-170) of CIB1 (hereafter CIBN) are important for light-induced dimerization46. Opto-Rho1DN contains two components. The first component is the CIBN protein fused with a CAAX anchor, which localizes the protein to the plasma membrane47. The second component is mCherry-tagged CRY2 fused with Rho1DN41. In the absence of blue light, CRY2-Rho1DN remains in the cytoplasm. Upon blue light stimulation, CRY2-Rho1DN is targeted to the plasma membrane through the interaction between membrane-anchored CIBN and excited CRY2. Opto-Rho1DN can be activated by ultraviolet A (UVA) light and blue light (400-500 nm, peak activation at 450-488 nm), or by an 830-980 nm pulsed laser when performing two-photon stimulation41,46,47,48. Therefore, Opto-Rho1DN is stimulated by wavelengths normally used for exciting GFP (488 nm for single photon imaging and 920 nm for two-photon imaging). In contrast, wavelengths commonly used for exciting mCherry (561 nm for single photon imaging and 1,040 nm for two-photon imaging) do not stimulate the optogenetic module and therefore can be used for pre-stimulation imaging. The protocol describes the approaches used to minimize the risk of unwanted stimulation during sample manipulation.
Laser ablation has been extensively employed to detect and measure tension in cells and tissues49. Previous studies have shown that, when laser intensity is appropriately controlled, two-photon laser ablation employing a femtosecond near-infrared laser can physically impair some subcellular structures (e.g., cortical actomyosin networks) without causing plasma membrane rapture50,51. If the tissue is under tension, laser ablation of a region of interest within the tissue results in an immediate outward recoil of the cells adjacent to the ablated region. The recoil velocity is a function of the magnitude of the tension and the viscosity of the media (cytoplasm) surrounding the structures undergoing recoil49. Because of the superior penetration depth of the near-infrared lasers and the ability to achieve well-confined focal ablation, two-photon laser ablation is particularly useful for detecting tissue tension in vivo. As demonstrated in this protocol, this method can be easily combined with Opto-Rho1DN-mediated inactivation of actomyosin contractility to investigate the direct impact of Rho1-dependent cellular contractility on tissue mechanics during dynamic tissue remodeling.

Författare i fokus: Optogenetisk hämning av Rho1-medierad aktomyosinkontraktilitet i kombination med mätning av epitelial spänning i Drosophila-embryon  

Optogenetisk hämning av rho1-medierad aktomyosinkontraktilitet i kombination med mätning av epitelspänning i Drosophila-embryon

Our research studies tissue morphogenesis, the formation of complex three-dimensional tissue structures in development. We are interested in the genes and the molecules that regulate morphogenesis and seek to understand the physical principles underlying morphogenesis. For example, how mechanical forces are generated and how they drive tissue rehabilitation.Contractile forces generated by filamentous actin and non-muscle myosin II, also known as actomyosin contractility, is one of the most important forces that drive tissue morphogenesis. Our current research addresses how actomyosin contractility mediates the folding of blood epithelial cell sheets, a fundamental tissue construction mechanism in development. An in-depth understanding of the role of actomyosin contractility in epithelial folding and other morphogenetic processes requires approaches that can quickly inactivate actomyosin at designated time and location, and records the immediate impact of tissue behavior and properties.However, this is difficult to achieve using conventional genetic approaches. The approach described in this protocol is designed to address how cells and tissues respond to sudden changes in mechanical forces that normally drive tissue remodeling. This is an important question but has been difficult to tackle due to limited approaches that can quickly alter mechanical forces in intact tissues.In this study, we developed an optogenetic tool to inactivate actomyosin at specific tissue regions in Drosophila embryos quickly. We found that combining these two with laser ablation to investigate the direct impact of actomyosin contractility on tissue mechanics in epithelial folding. Our findings provide new insights into the mechanical mechanism apical constriction media to epithelial folding.With manual modifications, the protocol can be easily adapted to study the function of actomyosin contractility in a wide range of morphogenetic processes.

Hos de ostimulerade embryon som genomgick apikal sammandragning anrikades Sqh-mCherry vid den medioapikala regionen av de ventrala mesodermala cellerna, medan CRY2-Rho1DN-mCherry var cytosolisk (Figur 1A). Laserablation inom sammandragningsdomänen ledde till en snabb vävnadsrekyl längs AP-axeln (Figur 1B,C). I de stimulerade embryona blev CRY2-Rho1DN-mCherry-signalen plasmamembranlokaliserad, medan den medioapikala signalen från Sqh-mCherry ...

Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos at JoVE.com

Actomyosinkontraktilitet spelar en viktig roll i cell- och vävnadsmorfogenesen. Det är dock utmanande att manipulera aktomyosinkontraktiliteten in vivo akut. Detta protokoll beskriver ett optogenetiskt system som snabbt hämmar Rho1-medierad aktomyosinkontraktilitet i Drosophila-embryon , vilket avslöjar den omedelbara förlusten av epitelspänning efter inaktivering av aktomyosin in vivo.

Contractile forces generated by actin and non-muscle myosin II ("actomyosin contractility") are critical for morphological changes of cells and tissues at ...

Vår forskning studerar vävnadsmorfogenes, bildandet av komplexa tredimensionella vävnadsstrukturer under utveckling. Vi är intresserade av de gener och molekyler som reglerar morfogenes och försöker förstå de fysikaliska principer som ligger till grund för morfogenesen. Till exempel hur mekaniska krafter genereras och hur de driver vävnadsrehabilitering.Kontraktila krafter som genereras av filamentöst aktin och icke-muskelmyosin II, även känd som aktomyosinkontraktilitet, är en av de viktigaste krafterna som driver vävnadsmorfogenes. Vår nuvarande forskning handlar om hur aktomyosinkontraktilitet medierar veckningen av blodepitelceller, en grundläggande vävnadskonstruktionsmekanism under utveckling. En djupgående förståelse av aktomyosinkontraktilitetens roll i epitelveckning och andra morfogenetiska processer kräver metoder som snabbt kan inaktivera aktomyosin vid bestämd tidpunkt och plats, och registrerar den omedelbara effekten av vävnadsbeteende och egenskaper.Detta är dock svårt att uppnå med konventionella genetiska metoder. Tillvägagångssättet som beskrivs i detta protokoll är utformat för att ta itu med hur celler och vävnader reagerar på plötsliga förändringar i mekaniska krafter som normalt driver vävnadsombyggnad. Detta är en viktig fråga men har varit svår att ta itu med på grund av begränsade tillvägagångssätt som snabbt kan förändra mekaniska krafter i intakta vävnader.I den här studien utvecklade vi ett optogenetiskt verktyg för att snabbt inaktivera aktomyosin i specifika vävnadsregioner i Drosophila-embryon. Vi fann att kombinera dessa två med laserablation för att undersöka den direkta effekten av aktomyosinkontraktilitet på vävnadsmekanik i epitelveckning. Våra fynd ger nya insikter om den mekaniska mekanismen apikala sammandragningsmedia till epitelveckning.Med manuella modifieringar kan protokollet enkelt anpassas för att studera funktionen av aktomyosinkontraktilitet i ett brett spektrum av morfogenetiska processer.

Optogenetisk hämning av rho1-medierad aktomyosinkontraktilitet i kombination med mätning av epitelspänning i Drosophila-embryon

Abstract