Kvantitativ påvisning af DNA-protein-tværbindinger og deres posttranslationelle modifikationer

DNA-protein-tværbindinger (DPC'er) er hyppige, allestedsnærværende og skadelige DNA-læsioner, der opstår fra endogene DNA-skader, enzym (topoisomeraser, methyltransferaser osv.), Der ikke fungerer korrekt, eller eksogene midler såsom kemoterapeutika og tværbindingsmidler. Når DPC'er er induceret, konjugeres flere typer posttranslationelle modifikationer (PTM'er) straks til dem som tidlige reaktionsmekanismer. Det har vist sig, at DPC'er kan modificeres af ubiquitin, lille ubiquitin-lignende modifikator (SUMO) og poly-ADP-ribose, som primer substraterne for at signalere deres respektive udpegede reparationsenzymer og i nogle tilfælde koordinere reparationen på sekventielle måder. Da PTM'er transspirerer hurtigt og er meget reversible, har det været udfordrende at isolere og detektere PTM-konjugerede DPC'er, der normalt forbliver på lave niveauer. Præsenteret her er et immunoassay til oprensning og kvantitativt detektering af ubiquitylerede, SUMOylerede og ADP-ribosylerede DPC'er (lægemiddelinducerede topoisomerase DPC'er og aldehydinducerede ikke-specifikke DPC'er) in vivo. Dette assay er afledt af RADAR-assayet (hurtig tilgang til DNA-adduktgendannelse), der anvendes til isolering af genomisk DNA indeholdende DPC'er ved ethanoludfældning. Efter normalisering og nukleasefordøjelse detekteres PTM'er af DPC'er, herunder ubiquitylering, SUMOylering og ADP-ribosylering, ved immunoblotting under anvendelse af deres tilsvarende antistoffer. Dette robuste assay kan bruges til at identificere og karakterisere nye molekylære mekanismer, der reparerer enzymatiske og ikke-enzymatiske DPC'er og har potentialet til at opdage små molekylehæmmere rettet mod specifikke faktorer, der regulerer PTM'er til reparation af DPC'er.