Kwantitatieve detectie van DNA-eiwit crosslinks en hun posttranslationele modificaties

DNA-eiwit crosslinks (DPC's) zijn frequente, alomtegenwoordige en schadelijke DNA-laesies, die voortkomen uit endogene DNA-schade, enzymen (topoisomerases, methyltransferasen, enz.) die niet goed functioneren, of exogene agentia zoals chemotherapeutica en crosslinking-middelen. Zodra DPC's zijn geïnduceerd, worden verschillende soorten posttranslationele modificaties (PTM's) onmiddellijk aan hen geconjugeerd als vroege responsmechanismen. Het is aangetoond dat DPC's kunnen worden gewijzigd door ubiquitine, kleine ubiquitine-achtige modifier (SUMO) en poly-ADP-ribose, die de substraten primen om hun respectieve aangewezen reparatie-enzymen te signaleren en, in sommige gevallen, de reparatie op opeenvolgende manieren te coördineren. Omdat PTM's snel transpireren en zeer omkeerbaar zijn, was het een uitdaging om PTM-geconjugeerde DPC's te isoleren en te detecteren die meestal op lage niveaus blijven. Hier wordt een immunoassay gepresenteerd om ubiquityleerde, SUMOylated en ADP-ribosylated DPC's (drug-induced topoisomerase DPCs en aldehyde-geïnduceerde niet-specifieke DPC's) in vivo te zuiveren en kwantitatief te detecteren. Deze test is afgeleid van de RADAR (rapid approach to DNA adduct recovery) assay die wordt gebruikt voor de isolatie van genomisch DNA dat DPC's bevat door ethanol precipitatie. Na normalisatie en nucleasevertering worden PTM's van DPC's, waaronder ubiquitylatie, SUMOylatie en ADP-ribosylatie, gedetecteerd door immunoblotting met behulp van hun overeenkomstige antilichamen. Deze robuuste test kan worden gebruikt om nieuwe moleculaire mechanismen te identificeren en te karakteriseren die enzymatische en niet-enzymatische DPC's repareren en heeft het potentieel om kleine molecuulremmers te ontdekken die zich richten op specifieke factoren die PTM's reguleren om DPC's te repareren.