Quantitativer Nachweis von DNA-Protein-Vernetzungen und deren posttranslationale Modifikationen

DNA-Protein-Crosslinks (DPCs) sind häufige, allgegenwärtige und schädliche DNA-Läsionen, die durch endogene DNA-Schäden, Fehlfunktionen von Enzymen (Topoisomerasen, Methyltransferasen usw.) oder exogene Wirkstoffe wie Chemotherapeutika und Vernetzungsmittel entstehen. Sobald DPCs induziert sind, werden mehrere Arten von posttranslationalen Modifikationen (PTMs) als frühe Reaktionsmechanismen sofort mit ihnen konjugiert. Es wurde gezeigt, dass DPCs durch Ubiquitin, kleine Ubiquitin-ähnliche Modifikatoren (SUMO) und Poly-ADP-Ribose modifiziert werden können, die die Substrate darauf vorbereiten, ihre jeweiligen Reparaturenzyme zu signalisieren und in einigen Fällen die Reparatur auf sequentielle Weise zu koordinieren. Da PTMs schnell transpirieren und hochgradig reversibel sind, war es schwierig, PTM-konjugierte DPCs zu isolieren und nachzuweisen, die normalerweise auf niedrigen Niveaus verbleiben. Hier wird ein Immunoassay zur Reinigung und quantitativen Detektion von ubiquitylierten, SUMOylierten und ADP-ribosylierten DPCs (arzneimittelinduzierte Topoisomerase-DPCs und Aldehyd-induzierte unspezifische DPCs) in vivo vorgestellt. Dieser Assay leitet sich vom RADAR-Assay (Rapid Approach to DNA Adduct Recovery) ab, der für die Isolierung von genomischer DNA, die DPCs enthält, durch Ethanolfällung verwendet wird. Nach Normalisierung und Nukleaseverdauung werden PTMs von DPCs, einschließlich Ubiquitylierung, SUMOylierung und ADP-Ribosylierung, durch Immunoblot mit den entsprechenden Antikörpern nachgewiesen. Dieser robuste Assay kann verwendet werden, um neue molekulare Mechanismen zu identifizieren und zu charakterisieren, die enzymatische und nicht-enzymatische DPCs reparieren, und hat das Potenzial, niedermolekulare Inhibitoren zu entdecken, die auf spezifische Faktoren abzielen, die PTMs zur Reparatur von DPCs regulieren.