Kvantitativ deteksjon av DNA-protein-tverrbindinger og deres posttranslasjonelle modifikasjoner

DNA-protein-tverrbindinger (DPC) er hyppige, allestedsnærværende og skadelige DNA-lesjoner, som oppstår ved endogen DNA-skade, enzym (topoisomeraser, metyltransferaser, etc.) som ikke fungerer, eller eksogene midler som kjemoterapeutika og kryssbindingsmidler. Når DPC er indusert, blir flere typer posttranslasjonelle modifikasjoner (PTM) raskt konjugert til dem som tidlige responsmekanismer. Det har vist seg at DPCer kan modifiseres av ubiquitin, liten ubiquitin-lignende modifikator (SUMO) og poly-ADP-ribose, som primer substratene for å signalisere deres respektive utpekte reparasjonsenzymer og i noen tilfeller koordinere reparasjonen i sekvensielle måter. Siden PTM-er kommer raskt og er svært reversible, har det vært utfordrende å isolere og oppdage PTM-konjugerte DPC-er som vanligvis forblir på lave nivåer. Presentert her er en immunoassay for å rense og kvantitativt oppdage ubiquitylerte, SUMOylerte og ADP-ribosylerte DPCer (legemiddelinduserte topoisomerase DPCer og aldehydinducerte ikke-spesifikke DPCer) in vivo. Denne analysen er avledet fra RADAR-analysen (rapid approach to DNA adduct recovery) som brukes til isolering av genomisk DNA som inneholder DPC ved etanolutfelling. Etter normalisering og nukleasefordøyelse detekteres PTM av DPCer, inkludert ubiquitylering, SUMOylering og ADP-ribosylering, ved immunoblotting ved bruk av deres tilsvarende antistoffer. Denne robuste analysen kan brukes til å identifisere og karakterisere nye molekylære mekanismer som reparerer enzymatiske og ikke-enzymatiske DPCer og har potensial til å oppdage småmolekylære hemmere rettet mot spesifikke faktorer som regulerer PTM for å reparere DPCer.