Количественная детекция ДНК-белковых сшивок и их посттрансляционных модификаций

ДНК-белковые сшивания (ДПК) — это частые, повсеместные и вредные повреждения ДНК, которые возникают в результате эндогенного повреждения ДНК, сбоев в работе ферментов (топоизомераз, метилтрансфераз и т. д.) или экзогенных агентов, таких как химиотерапевтические препараты и сшивающие агенты. После того, как ЦОД индуцированы, к ним оперативно привязываются несколько типов посттрансляционных модификаций (ПТМ) в качестве механизмов раннего реагирования. Было показано, что DPC могут модифицироваться убиквитином, малым убиквитин-подобным модификатором (SUMO) и поли-АДФ-рибозой, которые подготавливают субстраты для передачи сигналов соответствующим назначенным ферментам репарации и, в некоторых случаях, координируют репарацию последовательным образом. Поскольку ПТМ возникают быстро и являются высокообратимыми, было сложно выделить и обнаружить ЦОД, сопряженные с ПТМ, которые обычно остаются на низких уровнях. Здесь представлен иммуноферментный анализ для очистки и количественного обнаружения убиквитилированных, SUMOylированных и АДФ-рибозилированных DPC (лекарственно-индуцированные топоизомеразные DPC и альдегид-индуцированные неспецифические DPC) in vivo. Этот анализ является производным от анализа RADAR (быстрый подход к восстановлению аддуктов ДНК), который используется для выделения геномной ДНК, содержащей DPC, путем осаждения этанола. После нормализации и расщепления нуклеаз ПТМ ДПК, включая убиквитилирование, SUMOylation и ADP-рибозилирование, выявляются методом иммуноблоттинга с использованием соответствующих антител. Этот надежный анализ может быть использован для идентификации и характеристики новых молекулярных механизмов, которые восстанавливают ферментативные и неферментативные DPC, и имеет потенциал для обнаружения низкомолекулярных ингибиторов, нацеленных на конкретные факторы, регулирующие PTM для восстановления DPC.