Kvantitativ detektion av DNA-proteintvärbindningar och deras posttranslationella modifieringar

DNA-proteintvärbindningar (DPC) är frekventa, allestädes närvarande och skadliga DNA-lesioner, som uppstår på grund av endogena DNA-skador, enzym (topoisomeraser, metyltransferaser, etc.) som inte fungerar som de ska, eller exogena medel som kemoterapeutiska medel och tvärbindningsmedel. När DPC:er väl har inducerats konjugeras flera typer av posttranslationella modifieringar (PTM) omedelbart till dem som mekanismer för tidig respons. Det har visats att DPC:er kan modifieras av ubiquitin, liten ubiquitin-liknande modifierare (SUMO) och poly-ADP-ribos, som förbereder substraten för att signalera sina respektive utsedda reparationsenzymer och, i vissa fall, koordinerar reparationen på sekventiella sätt. Eftersom PTM transpirerar snabbt och är mycket reversibla har det varit utmanande att isolera och detektera PTM-konjugerade DPC:er som vanligtvis ligger kvar på låga nivåer. Här presenteras en immunanalys för att rena och kvantitativt detektera ubiquitylerade, SUMOylerade och ADP-ribosylerade DPC:er (läkemedelsinducerade topoisomeras DPC:er och aldehydinducerade icke-specifika DPC:er) in vivo. Denna analys härrör från RADAR-analysen (rapid approach to DNA adduct recovery) som används för isolering av genomiskt DNA som innehåller DPC genom etanolutfällning. Efter normalisering och nukleasnedbrytning detekteras PTM av DPC, inklusive ubiquitylering, SUMOylering och ADP-ribosylering, genom immunoblot med hjälp av motsvarande antikroppar. Denna robusta analys kan användas för att identifiera och karakterisera nya molekylära mekanismer som reparerar enzymatiska och icke-enzymatiska DPC:er och har potential att upptäcka småmolekylära hämmare som riktar sig mot specifika faktorer som reglerar PTM för att reparera DPC.