DNA-Protein Çapraz Bağlarının Kantitatif Tespiti ve Translasyon Sonrası Modifikasyonları

DNA-protein çapraz bağları (DPC'ler), endojen DNA hasarı, enzim (topoizomerazlar, metiltransferazlar, vb.) işlev bozukluğundan veya kemoterapötikler ve çapraz bağlama ajanları gibi eksojen ajanlardan kaynaklanan sık, her yerde bulunan ve zararlı DNA lezyonlarıdır. DPC'ler indüklendikten sonra, erken yanıt mekanizmaları olarak çeşitli translasyon sonrası modifikasyonlar (PTM'ler) derhal bunlara konjuge edilir. DPC'lerin, substratları ilgili belirlenmiş onarım enzimlerini işaret etmeye hazırlayan ve bazı durumlarda onarımı sıralı bir şekilde koordine eden ubikuitin, küçük ubikuitin benzeri değiştirici (SUMO) ve poli-ADP-riboz ile değiştirilebileceği gösterilmiştir. PTM'ler hızlı bir şekilde ortaya çıktığından ve yüksek oranda geri dönüşümlü olduğundan, genellikle düşük seviyelerde kalan PTM konjuge DPC'leri izole etmek ve tespit etmek zor olmuştur. Burada sunulan, ubikitile edilmiş, SUMOile edilmiş ve ADP-ribosillenmiş DPC'leri (ilaca bağlı topoizomeraz DPC'ler ve aldehit kaynaklı spesifik olmayan DPC'ler) in vivo saflaştırmak ve kantitatif olarak tespit etmek için bir immünolojik testtir. Bu tahlil, DPC'leri içeren genomik DNA'nın etanol çökeltme ile izolasyonu için kullanılan RADAR (DNA eklenti geri kazanımına hızlı yaklaşım) testinden türetilmiştir. Normalizasyon ve nükleaz sindirimini takiben, ubikitilasyon, SUMOylation ve ADP-ribosilasyon dahil olmak üzere DPC'lerin PTM'leri, karşılık gelen antikorları kullanılarak immünoblotlama ile tespit edilir. Bu sağlam test, enzimatik ve enzimatik olmayan DPC'leri onaran yeni moleküler mekanizmaları tanımlamak ve karakterize etmek için kullanılabilir ve DPC'leri onarmak için PTM'leri düzenleyen spesifik faktörleri hedefleyen küçük molekül inhibitörlerini keşfetme potansiyeline sahiptir.