זרימת עבודה משולבת לחקר ארכיטקטורת הגנום המרחבי-זמני הממוקדת במקדם באוכלוסיות תאים נדירות

Summary

ביטוי גנים מוסדר על ידי אינטראקציות של מקדמי גנים עם אלמנטים רגולטוריים דיסטליים. כאן, אנו מסבירים עד כמה קלט נמוך Capture Hi-C (liCHi-C) מאפשר לזהות אינטראקציות אלה בסוגי תאים נדירים, שבעבר לא היו ניתנים למדידה.

Abstract

שעתוק גנים מרחבי-זמני מוסדר באופן הדוק על ידי אלמנטים רגולטוריים דיסטליים, כגון משפרים ומשתיקי קול, המסתמכים על קרבה פיזית עם מקדמי גני המטרה שלהם כדי לשלוט בשעתוק. למרות שקל לזהות אלמנטים רגולטוריים אלה, קשה לחזות את גני המטרה שלהם, שכן רובם ספציפיים לסוג התא וניתן להפריד אותם על ידי מאות קילו-בסיסים ברצף הגנום הליניארי, תוך דילוג על גנים אחרים שאינם מטרה. במשך מספר שנים, Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) היה תקן הזהב לשיוך של אלמנטים רגולטוריים דיסטליים לגני המטרה שלהם. עם זאת, PCHi-C מסתמך על זמינותם של מיליוני תאים, ואוסר על מחקר של אוכלוסיות תאים נדירות כגון אלה המתקבלות בדרך כלל מרקמות ראשוניות. כדי להתגבר על מגבלה זו, פותחה Capture Hi-C (liCHi-C), שיטה חסכונית וניתנת להתאמה אישית לזיהוי רפרטואר של אלמנטים רגולטוריים דיסטליים השולטים בכל גן בגנום. liCHi-C מסתמך על מסגרת ניסויית וחישובית דומה לזו של PCHi-C, אך על ידי שימוש בשינויים מינימליים בצינור, שינוי ריכוז המגיב ונפחי הריאגנטים, והחלפה או ביטול שלבים, הוא אחראי לאובדן חומרים מינימלי במהלך בניית הספרייה. באופן קולקטיבי, liCHi-C מאפשר לחקור את בקרת הגנים ואת ארגון הגנום המרחבי-זמני בהקשר של ביולוגיה התפתחותית ותפקוד תאי.

Introduction

ביטוי גנים זמני מניע התמיינות תאים, ובסופו של דבר, התפתחות אורגניזם, והשינוי שלו קשור קשר הדוק למגוון רחב של מחלות 1,2,3,4,5. שעתוק גנים מוסדר היטב על ידי פעולתם של אלמנטים רגולטוריים, אשר יכולים להיות מסווגים כפרוקסימליים (כלומר, מקדמי גנים) ודיסטליים (למשל, משפרים או משתיקי קול), אשר האחרונים ממוקמים לעתים קרובות הרחק מגני המטרה שלהם ומתקשרים איתם פיזית באמצעות לולאת כרומטין כדי לווסת ביטוי גנים ^6,7,8.

Protocol

כדי להבטיח אובדן חומרים מינימלי, (1) עבוד עם צינורות וקצוות DNA בעלי קישור נמוך (ראה טבלת חומרים), (2) מקם ריאגנטים על דופן הצינור במקום להכניס את הקצה לתוך הדגימה, ו-(3) אם אפשר, ערבב את הדגימה על ידי היפוך במקום להציף את הדגימה למעלה ולמטה, והסתובב למטה לאחר מכן כדי לשחזר את הדגימה.

Discussion

liCHi-C מציעה את היכולת ליצור ספריות אינטראקטום מקדם ברזולוציה גבוהה באמצעות מסגרת ניסויית דומה מזו של PCHi-C, אך עם מספר תאים מופחת במידה ניכרת. זה מושג במידה רבה על ידי ביטול צעדים מיותרים, כגון טיהור פנול והסרת ביוטין. בפרוטוקול Hi-C הקלאסי של קשירת גרעין^{Hi-C 57} ובטכניקת הנגזרת שלו PCHi-.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4 mM Biotin-14-dATP	Invitrogen	19524-016
0.5 M EDTA pH 8.0	Invitrogen	AM9260G
1 M Tris pH 8.0	Invitrogen	AM9855G
10x NEBuffer 2	New England Biolabs	B7002S	Referenced as restriction buffer 2 in the manuscript
10x PBS	Fisher Scientific	BP3994
10x T4 DNA ligase reaction buffer	New England Biolabs	B0202S
16% formaldehyde solution (w/v), methanol-free	Thermo Scientific	28908
20 mg/mL Bovine Serum Albumin	New England Biolabs	B9000S
5 M NaCl	Invitrogen	AM9760G
5PRIME Phase Lock Gel Light tubes	Qiuantabio	2302820	For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube
Adapters and PCR primers for library amplification	Integrated DNA Technologies	-	Bought as individual primers with PAGE purification for NGS
Cell scrappers	Nunc	179693	Or any other brand
Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes)	Any brand
CHiCAGO R package	1.14.0
CleanNGS beads	CleanNA	CNGS-0050
dATP, dCTP, dGTP, dTTP	Promega	U120A, U121A, U122A, U123A	Or any other brand
DNA LoBind tube, 1.5 mL	Eppendorf	30108051
DNA LoBind tube, 2 mL	Eppendorf	30108078
DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL	New England Biolabs	M0210L
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads	Invitrogen	65002	For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down)
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads	Invitrogen	65602	For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
DynaMag-2	Invitrogen	12321D	Or any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL
Ethanol absolute	VWR	20821.321
FBS, qualified	Gibco	10270-106	Or any other brand
Glycine	Fisher BioReagents	BP381-1
GlycoBlue Coprecipitant	Invitrogen	AM9515	Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification)
HiCUP	0.8.2
HindIII, 100 U/µL	New England Biolabs	R0104T
IGEPAL CA-630	Sigma-Aldrich	I8896-50ML
Klenow EXO- 5000 units/mL	New England Biolabs	M0212L
Low-retention filter tips (10 µL, 20 µL, 200 µL and 1000 µL)	ZeroTip	PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000
M220 Focused-ultrasonicator	Covaris	500295
Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vials	Covaris	520045	For sonication in section 6 (sonication)
NheI-HF, 100 U/µL	New England Biolabs	R3131M
Nuclease-free molecular biology grade water	Sigma-Aldrich	W4502
PCR primers for quality controls	Integrated DNA Technologies	-
PCR strips and caps	Agilent Technologies	410022, 401425
Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA	Sigma-Aldrich	P3803
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer	New England Biolabs	M0531L	For amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification) and 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
Protease inhibitor cocktail (EDTA-free)	Roche	11873580001
Proteinase K, recombinant, PCR grade	Roche	3115836001
Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kit	Invitrogen	Q33230	For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification)
Qubit assay tubes	Invitrogen	Q32856
rCutsmart buffer	New England Biolabs	B6004S
RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX	Gibco	61870-010	Or any other brand
SDS - Solution 10% for molecular biology	PanReac AppliChem	A0676
Sodium acetate pH 5.2	Sigma-Aldrich	S7899-100ML
SureSelect custom 3-5.9 Mb library	Agilent Technologies	5190-4831	Custom designed mouse or human capture system, used for the capture
SureSelect Target Enrichment Box 1	Agilent Technologies	5190-8645	Used for the capture
SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full Adapter	Agilent Technologies	931107	Used for the capture
T4 DNA ligase 1 U/µL	Invitrogen	15224025	For ligation in section 3 (ligation and decrosslink)
T4 DNA ligase 2000000/mL	New England Biolabs	M0202T	For ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
T4 DNA polymerase 3000 units/mL	New England Biolabs	M0203L
T4 PNK 10000 units/mL	New England Biolabs	M0201L
Tapestation 4200 instrument	Agilent Technologies		For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Tapestation reagents	Agilent Technologies	5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585,	For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Triton X-100 for molecular biology	PanReac AppliChem	A4975
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416-50ML