A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
* These authors contributed equally
ביטוי גנים מוסדר על ידי אינטראקציות של מקדמי גנים עם אלמנטים רגולטוריים דיסטליים. כאן, אנו מסבירים עד כמה קלט נמוך Capture Hi-C (liCHi-C) מאפשר לזהות אינטראקציות אלה בסוגי תאים נדירים, שבעבר לא היו ניתנים למדידה.
שעתוק גנים מרחבי-זמני מוסדר באופן הדוק על ידי אלמנטים רגולטוריים דיסטליים, כגון משפרים ומשתיקי קול, המסתמכים על קרבה פיזית עם מקדמי גני המטרה שלהם כדי לשלוט בשעתוק. למרות שקל לזהות אלמנטים רגולטוריים אלה, קשה לחזות את גני המטרה שלהם, שכן רובם ספציפיים לסוג התא וניתן להפריד אותם על ידי מאות קילו-בסיסים ברצף הגנום הליניארי, תוך דילוג על גנים אחרים שאינם מטרה. במשך מספר שנים, Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) היה תקן הזהב לשיוך של אלמנטים רגולטוריים דיסטליים לגני המטרה שלהם. עם זאת, PCHi-C מסתמך על זמינותם של מיליוני תאים, ואוסר על מחקר של אוכלוסיות תאים נדירות כגון אלה המתקבלות בדרך כלל מרקמות ראשוניות. כדי להתגבר על מגבלה זו, פותחה Capture Hi-C (liCHi-C), שיטה חסכונית וניתנת להתאמה אישית לזיהוי רפרטואר של אלמנטים רגולטוריים דיסטליים השולטים בכל גן בגנום. liCHi-C מסתמך על מסגרת ניסויית וחישובית דומה לזו של PCHi-C, אך על ידי שימוש בשינויים מינימליים בצינור, שינוי ריכוז המגיב ונפחי הריאגנטים, והחלפה או ביטול שלבים, הוא אחראי לאובדן חומרים מינימלי במהלך בניית הספרייה. באופן קולקטיבי, liCHi-C מאפשר לחקור את בקרת הגנים ואת ארגון הגנום המרחבי-זמני בהקשר של ביולוגיה התפתחותית ותפקוד תאי.
ביטוי גנים זמני מניע התמיינות תאים, ובסופו של דבר, התפתחות אורגניזם, והשינוי שלו קשור קשר הדוק למגוון רחב של מחלות 1,2,3,4,5. שעתוק גנים מוסדר היטב על ידי פעולתם של אלמנטים רגולטוריים, אשר יכולים להיות מסווגים כפרוקסימליים (כלומר, מקדמי גנים) ודיסטליים (למשל, משפרים או משתיקי קול), אשר האחרונים ממוקמים לעתים קרובות הרחק מגני המטרה שלהם ומתקשרים איתם פיזית באמצעות לולאת כרומטין כדי לווסת ביטוי גנים 6,7,8.
כדי להבטיח אובדן חומרים מינימלי, (1) עבוד עם צינורות וקצוות DNA בעלי קישור נמוך (ראה טבלת חומרים), (2) מקם ריאגנטים על דופן הצינור במקום להכניס את הקצה לתוך הדגימה, ו-(3) אם אפשר, ערבב את הדגימה על ידי היפוך במקום להציף את הדגימה למעלה ולמטה, והסתובב למטה לאחר מכן כדי לשחזר את הדגימה.
liCHi-C מציעה את האפשרות ליצור ספריות אינטראקטום מקדמי גנום באיכות גבוהה וברזולוציה רחבה עם מעט כמו 50,000 תאים53. הדבר מושג על ידי – מלבד הפחתה דרסטית של נפחי התגובה ושימוש בכלי פלסטיק בעלי קישור נמוך לדנ"א לאורך כל הפרוטוקול – הסרת צעדים מיותרים מהפרוטוקול המקורי, שבהם מתרחשים הפ?.......
liCHi-C מציעה את היכולת ליצור ספריות אינטראקטום מקדם ברזולוציה גבוהה באמצעות מסגרת ניסויית דומה מזו של PCHi-C, אך עם מספר תאים מופחת במידה ניכרת. זה מושג במידה רבה על ידי ביטול צעדים מיותרים, כגון טיהור פנול והסרת ביוטין. בפרוטוקול Hi-C הקלאסי של קשירת גרעיןHi-C 57 ובטכניקת הנגזרת שלו PCHi-.......
אנו מודים לשאר החברים ממעבדת Javierre על המשוב שלהם על כתב היד. אנו מודים לתוכנית CERCA, Generalitat de Catalunya ולקרן Josep Carreras על התמיכה המוסדית. עבודה זו מומנה על ידי פדר / משרד המדע והחדשנות הספרדי (RTI2018-094788-A-I00), האגודה ההמטולוגית האירופית (4823998) והאגודה הספרדית נגד סרטן (AECC) LABAE21981JAVI. BMJ ממומן על ידי פרויקט Junior Leader של קרן הבנקאות La Caixa (LCF / BQ / PI19 / 11690001), LR ממומן על ידי מלגת AGAUR FI (2019FI-B00017), ו- LT-D ממומן על ידי מלגת FPI (PRE2019-088005). אנו מודים לתוכנית הדוקטורט בביוכימיה וביולוגיה מולקולרית מהאוניברסיטה האוטונומית של ברצלונה על תמיכתה. אף אחד מהמממנים לא היה מעורב בשום שלב בעיצוב הניסוי או בכתיבת כתב היד....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.4 mM Biotin-14-dATP | Invitrogen | 19524-016 | |
0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
1 M Tris pH 8.0 | Invitrogen | AM9855G | |
10x NEBuffer 2 | New England Biolabs | B7002S | Referenced as restriction buffer 2 in the manuscript |
10x PBS | Fisher Scientific | BP3994 | |
10x T4 DNA ligase reaction buffer | New England Biolabs | B0202S | |
16% formaldehyde solution (w/v), methanol-free | Thermo Scientific | 28908 | |
20 mg/mL Bovine Serum Albumin | New England Biolabs | B9000S | |
5 M NaCl | Invitrogen | AM9760G | |
5PRIME Phase Lock Gel Light tubes | Qiuantabio | 2302820 | For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube |
Adapters and PCR primers for library amplification | Integrated DNA Technologies | - | Bought as individual primers with PAGE purification for NGS |
Cell scrappers | Nunc | 179693 | Or any other brand |
Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes) | Any brand | ||
CHiCAGO R package | 1.14.0 | ||
CleanNGS beads | CleanNA | CNGS-0050 | |
dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Promega | U120A, U121A, U122A, U123A | Or any other brand |
DNA LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | 30108051 | |
DNA LoBind tube, 2 mL | Eppendorf | 30108078 | |
DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL | New England Biolabs | M0210L | |
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads | Invitrogen | 65002 | For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down) |
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads | Invitrogen | 65602 | For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification) |
DynaMag-2 | Invitrogen | 12321D | Or any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL |
Ethanol absolute | VWR | 20821.321 | |
FBS, qualified | Gibco | 10270-106 | Or any other brand |
Glycine | Fisher BioReagents | BP381-1 | |
GlycoBlue Coprecipitant | Invitrogen | AM9515 | Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification) |
HiCUP | 0.8.2 | ||
HindIII, 100 U/µL | New England Biolabs | R0104T | |
IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896-50ML | |
Klenow EXO- 5000 units/mL | New England Biolabs | M0212L | |
Low-retention filter tips (10 µL, 20 µL, 200 µL and 1000 µL) | ZeroTip | PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000 | |
M220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500295 | |
Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vials | Covaris | 520045 | For sonication in section 6 (sonication) |
NheI-HF, 100 U/µL | New England Biolabs | R3131M | |
Nuclease-free molecular biology grade water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
PCR primers for quality controls | Integrated DNA Technologies | - | |
PCR strips and caps | Agilent Technologies | 410022, 401425 | |
Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA | Sigma-Aldrich | P3803 | |
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531L | For amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification) and 11 (biotin pull-down and PCR amplification) |
Protease inhibitor cocktail (EDTA-free) | Roche | 11873580001 | |
Proteinase K, recombinant, PCR grade | Roche | 3115836001 | |
Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kit | Invitrogen | Q33230 | For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification) |
Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
rCutsmart buffer | New England Biolabs | B6004S | |
RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX | Gibco | 61870-010 | Or any other brand |
SDS - Solution 10% for molecular biology | PanReac AppliChem | A0676 | |
Sodium acetate pH 5.2 | Sigma-Aldrich | S7899-100ML | |
SureSelect custom 3-5.9 Mb library | Agilent Technologies | 5190-4831 | Custom designed mouse or human capture system, used for the capture |
SureSelect Target Enrichment Box 1 | Agilent Technologies | 5190-8645 | Used for the capture |
SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full Adapter | Agilent Technologies | 931107 | Used for the capture |
T4 DNA ligase 1 U/µL | Invitrogen | 15224025 | For ligation in section 3 (ligation and decrosslink) |
T4 DNA ligase 2000000/mL | New England Biolabs | M0202T | For ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification) |
T4 DNA polymerase 3000 units/mL | New England Biolabs | M0203L | |
T4 PNK 10000 units/mL | New England Biolabs | M0201L | |
Tapestation 4200 instrument | Agilent Technologies | For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid | |
Tapestation reagents | Agilent Technologies | 5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585, | For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid |
Triton X-100 for molecular biology | PanReac AppliChem | A4975 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved