Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ביטוי גנים מוסדר על ידי אינטראקציות של מקדמי גנים עם אלמנטים רגולטוריים דיסטליים. כאן, אנו מסבירים עד כמה קלט נמוך Capture Hi-C (liCHi-C) מאפשר לזהות אינטראקציות אלה בסוגי תאים נדירים, שבעבר לא היו ניתנים למדידה.

Abstract

שעתוק גנים מרחבי-זמני מוסדר באופן הדוק על ידי אלמנטים רגולטוריים דיסטליים, כגון משפרים ומשתיקי קול, המסתמכים על קרבה פיזית עם מקדמי גני המטרה שלהם כדי לשלוט בשעתוק. למרות שקל לזהות אלמנטים רגולטוריים אלה, קשה לחזות את גני המטרה שלהם, שכן רובם ספציפיים לסוג התא וניתן להפריד אותם על ידי מאות קילו-בסיסים ברצף הגנום הליניארי, תוך דילוג על גנים אחרים שאינם מטרה. במשך מספר שנים, Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) היה תקן הזהב לשיוך של אלמנטים רגולטוריים דיסטליים לגני המטרה שלהם. עם זאת, PCHi-C מסתמך על זמינותם של מיליוני תאים, ואוסר על מחקר של אוכלוסיות תאים נדירות כגון אלה המתקבלות בדרך כלל מרקמות ראשוניות. כדי להתגבר על מגבלה זו, פותחה Capture Hi-C (liCHi-C), שיטה חסכונית וניתנת להתאמה אישית לזיהוי רפרטואר של אלמנטים רגולטוריים דיסטליים השולטים בכל גן בגנום. liCHi-C מסתמך על מסגרת ניסויית וחישובית דומה לזו של PCHi-C, אך על ידי שימוש בשינויים מינימליים בצינור, שינוי ריכוז המגיב ונפחי הריאגנטים, והחלפה או ביטול שלבים, הוא אחראי לאובדן חומרים מינימלי במהלך בניית הספרייה. באופן קולקטיבי, liCHi-C מאפשר לחקור את בקרת הגנים ואת ארגון הגנום המרחבי-זמני בהקשר של ביולוגיה התפתחותית ותפקוד תאי.

Introduction

ביטוי גנים זמני מניע התמיינות תאים, ובסופו של דבר, התפתחות אורגניזם, והשינוי שלו קשור קשר הדוק למגוון רחב של מחלות 1,2,3,4,5. שעתוק גנים מוסדר היטב על ידי פעולתם של אלמנטים רגולטוריים, אשר יכולים להיות מסווגים כפרוקסימליים (כלומר, מקדמי גנים) ודיסטליים (למשל, משפרים או משתיקי קול), אשר האחרונים ממוקמים לעתים קרובות הרחק מגני המטרה שלהם ומתקשרים איתם פיזית באמצעות לולאת כרומטין כדי לווסת ביטוי גנים 6,7,8.

Protocol

כדי להבטיח אובדן חומרים מינימלי, (1) עבוד עם צינורות וקצוות DNA בעלי קישור נמוך (ראה טבלת חומרים), (2) מקם ריאגנטים על דופן הצינור במקום להכניס את הקצה לתוך הדגימה, ו-(3) אם אפשר, ערבב את הדגימה על ידי היפוך במקום להציף את הדגימה למעלה ולמטה, והסתובב למטה לאחר מכן כדי לשחזר את הדגימה.

Representative Results

liCHi-C מציעה את האפשרות ליצור ספריות אינטראקטום מקדמי גנום באיכות גבוהה וברזולוציה רחבה עם מעט כמו 50,000 תאים53. הדבר מושג על ידי – מלבד הפחתה דרסטית של נפחי התגובה ושימוש בכלי פלסטיק בעלי קישור נמוך לדנ"א לאורך כל הפרוטוקול – הסרת צעדים מיותרים מהפרוטוקול המקורי, שבהם מתרחשים הפ?.......

Discussion

liCHi-C מציעה את היכולת ליצור ספריות אינטראקטום מקדם ברזולוציה גבוהה באמצעות מסגרת ניסויית דומה מזו של PCHi-C, אך עם מספר תאים מופחת במידה ניכרת. זה מושג במידה רבה על ידי ביטול צעדים מיותרים, כגון טיהור פנול והסרת ביוטין. בפרוטוקול Hi-C הקלאסי של קשירת גרעיןHi-C 57 ובטכניקת הנגזרת שלו PCHi-.......

Acknowledgements

אנו מודים לשאר החברים ממעבדת Javierre על המשוב שלהם על כתב היד. אנו מודים לתוכנית CERCA, Generalitat de Catalunya ולקרן Josep Carreras על התמיכה המוסדית. עבודה זו מומנה על ידי פדר / משרד המדע והחדשנות הספרדי (RTI2018-094788-A-I00), האגודה ההמטולוגית האירופית (4823998) והאגודה הספרדית נגד סרטן (AECC) LABAE21981JAVI. BMJ ממומן על ידי פרויקט Junior Leader של קרן הבנקאות La Caixa (LCF / BQ / PI19 / 11690001), LR ממומן על ידי מלגת AGAUR FI (2019FI-B00017), ו- LT-D ממומן על ידי מלגת FPI (PRE2019-088005). אנו מודים לתוכנית הדוקטורט בביוכימיה וביולוגיה מולקולרית מהאוניברסיטה האוטונומית של ברצלונה על תמיכתה. אף אחד מהמממנים לא היה מעורב בשום שלב בעיצוב הניסוי או בכתיבת כתב היד....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.4 mM Biotin-14-dATPInvitrogen19524-016
0.5 M EDTA pH 8.0InvitrogenAM9260G
1 M Tris pH 8.0InvitrogenAM9855G
10x NEBuffer 2New England BiolabsB7002SReferenced as restriction buffer 2 in the manuscript
10x PBSFisher ScientificBP3994
10x T4 DNA ligase reaction bufferNew England BiolabsB0202S
16% formaldehyde solution (w/v), methanol-freeThermo Scientific28908
20 mg/mL Bovine Serum AlbuminNew England BiolabsB9000S
5 M NaClInvitrogenAM9760G
5PRIME Phase Lock Gel Light tubesQiuantabio2302820For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube
Adapters and PCR primers for library amplificationIntegrated DNA Technologies-Bought as individual primers with PAGE purification for NGS
Cell scrappersNunc179693Or any other brand
Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes)Any brand
CHiCAGO R package1.14.0
CleanNGS beadsCleanNACNGS-0050
dATP, dCTP, dGTP, dTTPPromegaU120A, U121A, U122A, U123AOr any other brand
DNA LoBind tube, 1.5 mLEppendorf30108051
DNA LoBind tube, 2 mLEppendorf30108078
DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mLNew England BiolabsM0210L
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beadsInvitrogen65002For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down)
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beadsInvitrogen65602For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
DynaMag-2Invitrogen12321DOr any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL
Ethanol absoluteVWR20821.321
FBS, qualifiedGibco10270-106Or any other brand
GlycineFisher BioReagentsBP381-1
GlycoBlue CoprecipitantInvitrogenAM9515Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification)
HiCUP0.8.2
HindIII, 100 U/µLNew England BiolabsR0104T
IGEPAL CA-630Sigma-AldrichI8896-50ML
Klenow EXO- 5000 units/mLNew England BiolabsM0212L
Low-retention filter tips (10 µL, 20 µL, 200 µL and 1000 µL)ZeroTipPMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000
M220 Focused-ultrasonicatorCovaris500295
Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vialsCovaris520045For sonication in section 6 (sonication)
NheI-HF, 100 U/µLNew England BiolabsR3131M
Nuclease-free molecular biology grade waterSigma-AldrichW4502
PCR primers for quality controlsIntegrated DNA Technologies-
PCR strips and capsAgilent Technologies410022, 401425
Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTASigma-AldrichP3803
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF BufferNew England BiolabsM0531LFor amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
and 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
Protease inhibitor cocktail (EDTA-free)Roche11873580001
Proteinase K, recombinant, PCR gradeRoche3115836001
Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kitInvitrogenQ33230For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification)
Qubit assay tubesInvitrogenQ32856
rCutsmart bufferNew England BiolabsB6004S
RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAXGibco61870-010Or any other brand
SDS - Solution 10% for molecular biologyPanReac AppliChemA0676
Sodium acetate pH 5.2Sigma-AldrichS7899-100ML
SureSelect custom 3-5.9 Mb libraryAgilent Technologies5190-4831Custom designed mouse or human capture system, used for the capture
SureSelect Target Enrichment Box 1Agilent Technologies5190-8645Used for the capture
SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full AdapterAgilent Technologies931107Used for the capture
T4 DNA ligase 1 U/µLInvitrogen15224025For ligation in section 3 (ligation and decrosslink)
T4 DNA ligase 2000000/mLNew England BiolabsM0202TFor ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
T4 DNA polymerase 3000 units/mLNew England BiolabsM0203L
T4 PNK 10000 units/mLNew England BiolabsM0201L
Tapestation 4200 instrumentAgilent TechnologiesFor automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and
section 11
(Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Tapestation reagentsAgilent Technologies5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585,For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and
section 11
(Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Triton X-100 for molecular biologyPanReac AppliChemA4975
Tween 20Sigma-AldrichP9416-50ML

References

  1. Hatton, C. S., et al. α-thalassemia caused by a large (62 kb) deletion upstream of the human α globin gene cluster. Blood. 76 (1), 221-227 (1990).
  2. Toikkanen, S., Helin, H., Isola, J., Joensuu, H.

Explore More Articles

194

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved