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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

A expressão gênica é regulada por interações de promotores gênicos com elementos regulatórios distais. Aqui, descrevemos como a baixa entrada de Capture Hi-C (liCHi-C) permite a identificação dessas interações em tipos celulares raros, que antes eram imensuráveis.

Abstract

A transcrição espacial temporal de genes é fortemente regulada por elementos regulatórios distais, como intensificadores e silenciadores, que dependem da proximidade física com seus promotores gênicos alvo para controlar a transcrição. Embora esses elementos regulatórios sejam fáceis de identificar, seus genes-alvo são difíceis de prever, uma vez que a maioria deles é específica do tipo celular e pode ser separada por centenas de quilobases na sequência linear do genoma, pulando sobre outros genes não-alvo. Por vários anos, o Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) tem sido o padrão-ouro para a associação de elementos regulatórios distais aos seus genes-alvo. No entanto, a PCHi-C depende da disponibilidade de milhões de células, proibindo o estudo de populações celulares raras, como as comumente obtidas de tecidos primários. Para superar essa limitação, foi desenvolvido o Low input Capture Hi-C (liCHi-C), um método econômico e personalizável para identificar o repertório de elementos regulatórios distais que controlam cada gene do genoma. O liCHi-C baseia-se em uma estrutura experimental e computacional semelhante à PCHi-C, mas empregando mudanças mínimas de tubo, modificando a concentração e os volumes do reagente e trocando ou eliminando etapas, ele é responsável por uma perda mínima de material durante a construção da biblioteca. Coletivamente, o liCHi-C possibilita o estudo da regulação gênica e da organização espaço-temporal do genoma no contexto da biologia do desenvolvimento e da função celular.

Introduction

A expressão gênica temporal impulsiona a diferenciação celular e, em última instância, o desenvolvimento do organismo, e sua alteração está intimamente relacionada a uma ampla gama de doenças1,2,3,4,5. A transcrição gênica é finamente regulada pela ação de elementos regulatórios, que podem ser classificados em proximais (i.e., promotores gênicos) e distais (e.g., intensificadores ou silenciadores), estes últimos frequentemente localizados distantes de seus genes-alvo e interagindo fisicamente com eles atrav....

Protocol

Para garantir uma perda mínima de material, (1) trabalhar com tubos e pontas de baixa ligação de ADN (ver Tabela de Materiais), (2) colocar reagentes na parede do tubo em vez de introduzir a ponta no interior da amostra e, (3) se possível, misturar a amostra por inversão em vez de pipetar a amostra para cima e para baixo, e girar para baixo depois para recuperar a amostra.

1. Fixação celular

  1. Células crescendo em suspensão
    1. Colher 50.00.......

Representative Results

O liCHi-C oferece a possibilidade de gerar bibliotecas de interatoma promotor genômico de alta qualidade e resolução com apenas 50.000 células53. Isso é conseguido por – além da redução drástica dos volumes de reação e do uso de plástico de baixa ligação de DNA em todo o protocolo – removendo etapas desnecessárias do protocolo original, nas quais ocorrem perdas significativas de material. Estes incluem a purificação de fenol após a desreticulação, a remoção de biotina e s.......

Discussion

O liCHi-C oferece a capacidade de gerar bibliotecas de interatoma promotor de alta resolução usando uma estrutura experimental semelhante à da PCHi-C, mas com um número de células muito reduzido. Isso é muito conseguido eliminando etapas desnecessárias, como purificação de fenol e remoção de biotina. No protocolo clássico de ligadura intranúcleo Hi-C57 e sua subsequente técnica derivada PCHi-C, a biotina é removida de fragmentos de restrição não ligados para evitar puxar para bai.......

Acknowledgements

Agradecemos ao resto dos membros do laboratório Javierre por seu feedback sobre o manuscrito. Agradecemos ao Programa CERCA, à Generalitat de Catalunya e à Fundação Josep Carreras pelo apoio institucional. Este trabalho foi financiado pelo FEDER/Ministério da Ciência e Inovação da Espanha (RTI2018-094788-A-I00), pela Associação Europeia de Hematologia (4823998) e pela Associação Espanhola contra o Câncer (AECC) LABAE21981JAVI. O BMJ é financiado pelo projeto Líder Júnior da Fundação Bancária La Caixa (LCF/BQ/PI19/11690001), o LR é financiado por uma bolsa AGAUR FI (2019FI-B00017) e o LT-D é financiado por uma bolsa FPI (PRE2019-088005). Agradecemos ao programa de dout....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.4 mM Biotin-14-dATPInvitrogen19524-016
0.5 M EDTA pH 8.0InvitrogenAM9260G
1 M Tris pH 8.0InvitrogenAM9855G
10x NEBuffer 2New England BiolabsB7002SReferenced as restriction buffer 2 in the manuscript
10x PBSFisher ScientificBP3994
10x T4 DNA ligase reaction bufferNew England BiolabsB0202S
16% formaldehyde solution (w/v), methanol-freeThermo Scientific28908
20 mg/mL Bovine Serum AlbuminNew England BiolabsB9000S
5 M NaClInvitrogenAM9760G
5PRIME Phase Lock Gel Light tubesQiuantabio2302820For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube
Adapters and PCR primers for library amplificationIntegrated DNA Technologies-Bought as individual primers with PAGE purification for NGS
Cell scrappersNunc179693Or any other brand
Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes)Any brand
CHiCAGO R package1.14.0
CleanNGS beadsCleanNACNGS-0050
dATP, dCTP, dGTP, dTTPPromegaU120A, U121A, U122A, U123AOr any other brand
DNA LoBind tube, 1.5 mLEppendorf30108051
DNA LoBind tube, 2 mLEppendorf30108078
DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mLNew England BiolabsM0210L
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beadsInvitrogen65002For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down)
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beadsInvitrogen65602For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
DynaMag-2Invitrogen12321DOr any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL
Ethanol absoluteVWR20821.321
FBS, qualifiedGibco10270-106Or any other brand
GlycineFisher BioReagentsBP381-1
GlycoBlue CoprecipitantInvitrogenAM9515Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification)
HiCUP0.8.2
HindIII, 100 U/µLNew England BiolabsR0104T
IGEPAL CA-630Sigma-AldrichI8896-50ML
Klenow EXO- 5000 units/mLNew England BiolabsM0212L
Low-retention filter tips (10 µL, 20 µL, 200 µL and 1000 µL)ZeroTipPMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000
M220 Focused-ultrasonicatorCovaris500295
Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vialsCovaris520045For sonication in section 6 (sonication)
NheI-HF, 100 U/µLNew England BiolabsR3131M
Nuclease-free molecular biology grade waterSigma-AldrichW4502
PCR primers for quality controlsIntegrated DNA Technologies-
PCR strips and capsAgilent Technologies410022, 401425
Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTASigma-AldrichP3803
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF BufferNew England BiolabsM0531LFor amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
and 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
Protease inhibitor cocktail (EDTA-free)Roche11873580001
Proteinase K, recombinant, PCR gradeRoche3115836001
Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kitInvitrogenQ33230For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification)
Qubit assay tubesInvitrogenQ32856
rCutsmart bufferNew England BiolabsB6004S
RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAXGibco61870-010Or any other brand
SDS - Solution 10% for molecular biologyPanReac AppliChemA0676
Sodium acetate pH 5.2Sigma-AldrichS7899-100ML
SureSelect custom 3-5.9 Mb libraryAgilent Technologies5190-4831Custom designed mouse or human capture system, used for the capture
SureSelect Target Enrichment Box 1Agilent Technologies5190-8645Used for the capture
SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full AdapterAgilent Technologies931107Used for the capture
T4 DNA ligase 1 U/µLInvitrogen15224025For ligation in section 3 (ligation and decrosslink)
T4 DNA ligase 2000000/mLNew England BiolabsM0202TFor ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
T4 DNA polymerase 3000 units/mLNew England BiolabsM0203L
T4 PNK 10000 units/mLNew England BiolabsM0201L
Tapestation 4200 instrumentAgilent TechnologiesFor automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and
section 11
(Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Tapestation reagentsAgilent Technologies5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585,For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and
section 11
(Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Triton X-100 for molecular biologyPanReac AppliChemA4975
Tween 20Sigma-AldrichP9416-50ML

References

  1. Hatton, C. S., et al. α-thalassemia caused by a large (62 kb) deletion upstream of the human α globin gene cluster. Blood. 76 (1), 221-227 (1990).
  2. Toikkanen, S., Helin, H., Isola, J., Joensuu, H.

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