Интегрированный рабочий процесс для изучения промоторно-ориентированной пространственно-временной архитектуры генома в дефицитных клеточных популяциях

Summary

Экспрессия генов регулируется взаимодействием промоторов генов с дистальными регуляторными элементами. Здесь мы рассмотрим, как низкий входной захват Hi-C (liCHi-C) позволяет идентифицировать эти взаимодействия в редких типах клеток, которые ранее не поддавались измерению.

Abstract

Пространственно-временная транскрипция генов жестко регулируется дистальными регуляторными элементами, такими как энхансеры и глушители, которые полагаются на физическую близость к своим целевым промоторам генов для контроля транскрипции. Хотя эти регуляторные элементы легко идентифицировать, их гены-мишени трудно предсказать, поскольку большинство из них специфичны для клеточного типа и могут быть разделены сотнями килобаз в линейной последовательности генома, пропуская другие нецелевые гены. В течение нескольких лет Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) был золотым стандартом ассоциации дистальных регуляторных элементов с их генами-мишенями. Тем не менее, PCHi-C полагается на наличие миллионов клеток, что запрещает изучение редких клеточных популяций, таких как те, которые обычно получают из первичных тканей. Чтобы преодолеть это ограничение, был разработан низковходной захват Hi-C (liCHi-C), экономически эффективный и настраиваемый метод идентификации репертуара дистальных регуляторных элементов, контролирующих каждый ген генома. liCHi-C опирается на аналогичную экспериментальную и вычислительную структуру, что и PCHi-C, но, используя минимальные изменения трубок, изменяя концентрацию и объемы реагентов, а также заменяя или устраняя шаги, он учитывает минимальные потери материала при строительстве библиотеки. В совокупности liCHi-C позволяет изучать регуляцию генов и пространственно-временную организацию генома в контексте биологии развития и клеточной функции.

Introduction

Временная экспрессия генов стимулирует дифференцировку клеток и, в конечном счете, развитие организма, и ее изменение тесно связано с широким спектром заболеваний 1,2,3,4,5. Транскрипция генов тонко регулируется действием регуляторных элементов, которые можно классифицировать как проксимальные (т.е. промоторы генов) и дистальные (например, энхансеры или глушители), последние из которых часто расположены далеко от своих генов-мишеней и физически взаимодействуют с ними посредством петли хроматина для модуляци....

Protocol

Чтобы обеспечить минимальные потери материала, (1) работайте с пробирками и наконечниками с низким связыванием ДНК (см. Таблицу материалов), (2) поместите реагенты на стенку пробирки вместо того, чтобы вводить наконечник внутрь образца и, (3) если возможно, смешайте образец путем и.......

Discussion

liCHi-C предлагает возможность создания библиотек промоторных интерактомов с высоким разрешением, используя аналогичную экспериментальную структуру PCHi-C, но со значительно уменьшенным числом клеток. Это в значительной степени достигается за счет устранения ненужных этапов, таких как оч.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4 mM Biotin-14-dATP	Invitrogen	19524-016
0.5 M EDTA pH 8.0	Invitrogen	AM9260G
1 M Tris pH 8.0	Invitrogen	AM9855G
10x NEBuffer 2	New England Biolabs	B7002S	Referenced as restriction buffer 2 in the manuscript
10x PBS	Fisher Scientific	BP3994
10x T4 DNA ligase reaction buffer	New England Biolabs	B0202S
16% formaldehyde solution (w/v), methanol-free	Thermo Scientific	28908
20 mg/mL Bovine Serum Albumin	New England Biolabs	B9000S
5 M NaCl	Invitrogen	AM9760G
5PRIME Phase Lock Gel Light tubes	Qiuantabio	2302820	For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube
Adapters and PCR primers for library amplification	Integrated DNA Technologies	-	Bought as individual primers with PAGE purification for NGS
Cell scrappers	Nunc	179693	Or any other brand
Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes)	Any brand
CHiCAGO R package	1.14.0
CleanNGS beads	CleanNA	CNGS-0050
dATP, dCTP, dGTP, dTTP	Promega	U120A, U121A, U122A, U123A	Or any other brand
DNA LoBind tube, 1.5 mL	Eppendorf	30108051
DNA LoBind tube, 2 mL	Eppendorf	30108078
DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL	New England Biolabs	M0210L
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads	Invitrogen	65002	For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down)
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads	Invitrogen	65602	For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
DynaMag-2	Invitrogen	12321D	Or any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL
Ethanol absolute	VWR	20821.321
FBS, qualified	Gibco	10270-106	Or any other brand
Glycine	Fisher BioReagents	BP381-1
GlycoBlue Coprecipitant	Invitrogen	AM9515	Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification)
HiCUP	0.8.2
HindIII, 100 U/µL	New England Biolabs	R0104T
IGEPAL CA-630	Sigma-Aldrich	I8896-50ML
Klenow EXO- 5000 units/mL	New England Biolabs	M0212L
Low-retention filter tips (10 µL, 20 µL, 200 µL and 1000 µL)	ZeroTip	PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000
M220 Focused-ultrasonicator	Covaris	500295
Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vials	Covaris	520045	For sonication in section 6 (sonication)
NheI-HF, 100 U/µL	New England Biolabs	R3131M
Nuclease-free molecular biology grade water	Sigma-Aldrich	W4502
PCR primers for quality controls	Integrated DNA Technologies	-
PCR strips and caps	Agilent Technologies	410022, 401425
Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA	Sigma-Aldrich	P3803
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer	New England Biolabs	M0531L	For amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification) and 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
Protease inhibitor cocktail (EDTA-free)	Roche	11873580001
Proteinase K, recombinant, PCR grade	Roche	3115836001
Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kit	Invitrogen	Q33230	For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification)
Qubit assay tubes	Invitrogen	Q32856
rCutsmart buffer	New England Biolabs	B6004S
RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX	Gibco	61870-010	Or any other brand
SDS - Solution 10% for molecular biology	PanReac AppliChem	A0676
Sodium acetate pH 5.2	Sigma-Aldrich	S7899-100ML
SureSelect custom 3-5.9 Mb library	Agilent Technologies	5190-4831	Custom designed mouse or human capture system, used for the capture
SureSelect Target Enrichment Box 1	Agilent Technologies	5190-8645	Used for the capture
SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full Adapter	Agilent Technologies	931107	Used for the capture
T4 DNA ligase 1 U/µL	Invitrogen	15224025	For ligation in section 3 (ligation and decrosslink)
T4 DNA ligase 2000000/mL	New England Biolabs	M0202T	For ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
T4 DNA polymerase 3000 units/mL	New England Biolabs	M0203L
T4 PNK 10000 units/mL	New England Biolabs	M0201L
Tapestation 4200 instrument	Agilent Technologies		For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Tapestation reagents	Agilent Technologies	5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585,	For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Triton X-100 for molecular biology	PanReac AppliChem	A4975
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416-50ML