Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Экспрессия генов регулируется взаимодействием промоторов генов с дистальными регуляторными элементами. Здесь мы рассмотрим, как низкий входной захват Hi-C (liCHi-C) позволяет идентифицировать эти взаимодействия в редких типах клеток, которые ранее не поддавались измерению.

Abstract

Пространственно-временная транскрипция генов жестко регулируется дистальными регуляторными элементами, такими как энхансеры и глушители, которые полагаются на физическую близость к своим целевым промоторам генов для контроля транскрипции. Хотя эти регуляторные элементы легко идентифицировать, их гены-мишени трудно предсказать, поскольку большинство из них специфичны для клеточного типа и могут быть разделены сотнями килобаз в линейной последовательности генома, пропуская другие нецелевые гены. В течение нескольких лет Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) был золотым стандартом ассоциации дистальных регуляторных элементов с их генами-мишенями. Тем не менее, PCHi-C полагается на наличие миллионов клеток, что запрещает изучение редких клеточных популяций, таких как те, которые обычно получают из первичных тканей. Чтобы преодолеть это ограничение, был разработан низковходной захват Hi-C (liCHi-C), экономически эффективный и настраиваемый метод идентификации репертуара дистальных регуляторных элементов, контролирующих каждый ген генома. liCHi-C опирается на аналогичную экспериментальную и вычислительную структуру, что и PCHi-C, но, используя минимальные изменения трубок, изменяя концентрацию и объемы реагентов, а также заменяя или устраняя шаги, он учитывает минимальные потери материала при строительстве библиотеки. В совокупности liCHi-C позволяет изучать регуляцию генов и пространственно-временную организацию генома в контексте биологии развития и клеточной функции.

Introduction

Временная экспрессия генов стимулирует дифференцировку клеток и, в конечном счете, развитие организма, и ее изменение тесно связано с широким спектром заболеваний 1,2,3,4,5. Транскрипция генов тонко регулируется действием регуляторных элементов, которые можно классифицировать как проксимальные (т.е. промоторы генов) и дистальные (например, энхансеры или глушители), последние из которых часто расположены далеко от своих генов-мишеней и физически взаимодействуют с ними посредством петли хроматина для модуляци....

Protocol

Чтобы обеспечить минимальные потери материала, (1) работайте с пробирками и наконечниками с низким связыванием ДНК (см. Таблицу материалов), (2) поместите реагенты на стенку пробирки вместо того, чтобы вводить наконечник внутрь образца и, (3) если возможно, смешайте образец путем и.......

Representative Results

liCHi-C предлагает возможность создания высококачественных библиотек промоторных интерактомов с разрешением всего лишь 50 000клеток53. Это достигается за счет - помимо резкого сокращения объемов реакции и использования пластиковой посуды с низким связыванием ДНК во всем прото.......

Discussion

liCHi-C предлагает возможность создания библиотек промоторных интерактомов с высоким разрешением, используя аналогичную экспериментальную структуру PCHi-C, но со значительно уменьшенным числом клеток. Это в значительной степени достигается за счет устранения ненужных этапов, таких как оч.......

Acknowledgements

Мы благодарим остальных сотрудников лаборатории Хавьера за отзыв о рукописи. Мы благодарим Программу CERCA, Женералитат Каталонии и Фонд Хосепа Каррераса за институциональную поддержку. Эта работа финансировалась FEDER/Министерством науки и инноваций Испании (RTI2018-094788-A-I00), Европейской гематологической ассоциацией (4823998) и Испанской ассоциацией по борьбе с раком (AECC) LABAE21981JAVI. BMJ финансируется проектом «Младший лидер» La Caixa Banking Foundation (LCF/BQ/PI19/11690001), LR финансируется стипендией AGAUR FI (2019FI-B00017), а LT-D финансируется стипендией FPI (PRE2019-088005). Мы благодарим докторскую программу по биохимии и молекулярной биологии из ....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.4 mM Biotin-14-dATPInvitrogen19524-016
0.5 M EDTA pH 8.0InvitrogenAM9260G
1 M Tris pH 8.0InvitrogenAM9855G
10x NEBuffer 2New England BiolabsB7002SReferenced as restriction buffer 2 in the manuscript
10x PBSFisher ScientificBP3994
10x T4 DNA ligase reaction bufferNew England BiolabsB0202S
16% formaldehyde solution (w/v), methanol-freeThermo Scientific28908
20 mg/mL Bovine Serum AlbuminNew England BiolabsB9000S
5 M NaClInvitrogenAM9760G
5PRIME Phase Lock Gel Light tubesQiuantabio2302820For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube
Adapters and PCR primers for library amplificationIntegrated DNA Technologies-Bought as individual primers with PAGE purification for NGS
Cell scrappersNunc179693Or any other brand
Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes)Any brand
CHiCAGO R package1.14.0
CleanNGS beadsCleanNACNGS-0050
dATP, dCTP, dGTP, dTTPPromegaU120A, U121A, U122A, U123AOr any other brand
DNA LoBind tube, 1.5 mLEppendorf30108051
DNA LoBind tube, 2 mLEppendorf30108078
DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mLNew England BiolabsM0210L
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beadsInvitrogen65002For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down)
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beadsInvitrogen65602For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
DynaMag-2Invitrogen12321DOr any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL
Ethanol absoluteVWR20821.321
FBS, qualifiedGibco10270-106Or any other brand
GlycineFisher BioReagentsBP381-1
GlycoBlue CoprecipitantInvitrogenAM9515Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification)
HiCUP0.8.2
HindIII, 100 U/µLNew England BiolabsR0104T
IGEPAL CA-630Sigma-AldrichI8896-50ML
Klenow EXO- 5000 units/mLNew England BiolabsM0212L
Low-retention filter tips (10 µL, 20 µL, 200 µL and 1000 µL)ZeroTipPMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000
M220 Focused-ultrasonicatorCovaris500295
Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vialsCovaris520045For sonication in section 6 (sonication)
NheI-HF, 100 U/µLNew England BiolabsR3131M
Nuclease-free molecular biology grade waterSigma-AldrichW4502
PCR primers for quality controlsIntegrated DNA Technologies-
PCR strips and capsAgilent Technologies410022, 401425
Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTASigma-AldrichP3803
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF BufferNew England BiolabsM0531LFor amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
and 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
Protease inhibitor cocktail (EDTA-free)Roche11873580001
Proteinase K, recombinant, PCR gradeRoche3115836001
Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kitInvitrogenQ33230For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification)
Qubit assay tubesInvitrogenQ32856
rCutsmart bufferNew England BiolabsB6004S
RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAXGibco61870-010Or any other brand
SDS - Solution 10% for molecular biologyPanReac AppliChemA0676
Sodium acetate pH 5.2Sigma-AldrichS7899-100ML
SureSelect custom 3-5.9 Mb libraryAgilent Technologies5190-4831Custom designed mouse or human capture system, used for the capture
SureSelect Target Enrichment Box 1Agilent Technologies5190-8645Used for the capture
SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full AdapterAgilent Technologies931107Used for the capture
T4 DNA ligase 1 U/µLInvitrogen15224025For ligation in section 3 (ligation and decrosslink)
T4 DNA ligase 2000000/mLNew England BiolabsM0202TFor ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
T4 DNA polymerase 3000 units/mLNew England BiolabsM0203L
T4 PNK 10000 units/mLNew England BiolabsM0201L
Tapestation 4200 instrumentAgilent TechnologiesFor automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and
section 11
(Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Tapestation reagentsAgilent Technologies5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585,For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and
section 11
(Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Triton X-100 for molecular biologyPanReac AppliChemA4975
Tween 20Sigma-AldrichP9416-50ML

References

  1. Hatton, C. S., et al. α-thalassemia caused by a large (62 kb) deletion upstream of the human α globin gene cluster. Blood. 76 (1), 221-227 (1990).
  2. Toikkanen, S., Helin, H., Isola, J., Joensuu, H.

Explore More Articles

194

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved