Detecção Simultânea de Diferentes Classes de Anticorpos em um Teste Sorológico Multiplexado

Summary

Um sistema de análise de fluxo de fluorescência de três canais de duplo repórter foi usado para desenvolver um imunoensaio multiplex baseado em esferas que avalia simultaneamente amostras de soro para IgG e IgM eliciadas contra múltiplos antígenos de diferentes espécies de Borrelia que causam borreliose de Lyme na Europa e América do Norte.

Abstract

Para monitorar a progressão de doenças infecciosas, é útil avaliar a imunorreatividade contra vários determinantes antigênicos e medir diferentes isotipos de anticorpos, pois eles aparecem em diferentes estágios da resposta imune do hospedeiro. Com a borreliose de Lyme, o agente patogênico pode ser um dos múltiplos membros da espécie Borrelia . Portanto, a correta classificação das amostras requer a avaliação da imunorreatividade contra diferentes antígenos de diferentes espécies de Borrelia . Além disso, as respostas IgG e IgM antipatogênicas podem ter diferentes cursos de tempo de eliciação durante a progressão da doença. Aqui demonstramos o desenvolvimento de um imunoensaio multiplex de dois repórteres que tem utilidade em identificar a resposta imune Borrelia-específica em amostras de soro humano, avaliando simultaneamente a imunorreatividade de IgG e IgM contra antígenos bacterianos diferentes na mesma reação. Essa abordagem de repórter duplo mantém o desempenho analítico dos métodos de repórter único, economizando tempo e recursos e reduzindo os requisitos de tamanho de amostra. Este ensaio permite essencialmente o dobro da informação serológica a ser gerada a partir de uma amostra de sangue em metade do tempo.

Introduction

A borreliose de Lyme é a doença infecciosa transmitida por carrapatos mais comum em climas moderados do hemisfério norte¹. É causada por bactérias espiroquetas do gênero Borrelia, com cinco patógenos humanos conhecidos que variam em distribuição geográfica². As principais espécies patogênicas de Borrelia na Europa são B. afzelii e B. garinii, sendo B. burgdorferi s.s., B. spielmanii e B. bavariensis implicadas com menor frequência. Na América do Norte, B. burgdorferi s.s. é o único agente causador da borreliose de Lyme ^2,3. Os patógenos da borrelia são transmitidos por membros do gênero Ixodes, podendo a transmissão ocorrer em até 24 horas após a picada do carrapato4.

O diagnóstico de borreliose de Lyme é tipicamente feito por sintomas clínicos e posteriormente confirmado por sorologia. Tanto na Europa quanto na América do Norte, as diretrizes diagnósticas recomendam uma série de testes em duas etapas que consiste em um ensaio imunoenzimático (ELISA) com um immunoblot reflexo para avaliar a resposta de anticorpos contra antígenos específicos da Borrelia 1,5,6,7,8,9 . No entanto, essa abordagem não tem sensibilidade e é subótima, particularmente na fase inicial da infecção, quando a soroconversão pode ser incompleta e os títulos de IgG e IgM antiborrelia são muito baixos⁶.

Os imunoensaios multiplex melhoram os imunoensaios tradicionais, que medem apenas um alvo de cada vez e podem avaliar simultaneamente múltiplas respostas isotípicas de anticorpos contra um ou mais antígenos 10,11,12. Ensaios como ELISAs limitam-se a identificar e quantificar um único analito por reação, no caso atual IgG ou IgM circulante induzida contra um único antígeno bacteriano após infecção por Borrelia. Este relato ilustra o uso da tecnologia de perfil de analitos baseada em contas para o desenvolvimento de um imunoensaio multiplex que detecta simultaneamente anticorpos IgG e IgM contra qualquer um dos antígenos de Borrelia aqui escolhidos em amostras de soro humano. Foram selecionados quatro antígenos que, juntos, cobrem as espécies patogênicas mais comuns de Borrelia nativas da Europa (B. Garinii, B. afzelii, B. burgdorferi s.s.) e América do Norte (B. burgdorferi s.s.) (Tabela 1) ^2.3. Isso permite a identificação decisiva do patógeno e a capacidade de discernir a imunorreatividade IgM precoce e, posteriormente, mais durável, IgG em amostras de pacientes.

Isótipo alvo	Canal do Repórter	Antígeno	Espécies de Borrelia	Coar	Concentração de acoplamento de antígeno
Grão-mestre	PE	OspC	B. garinii |	20047	5,0 μg/106 contas
IgG	BV421	VlsE	B. burgdorferi s.s	B31	1,25 μg/106 contas
IgG	BV421	DbpA	B. burgdorferi s.s.	ZS7	10,0 μg/106 contas
IgG	BV421	DbpA	B. afzelii	PKo	5,0 μg/106 contas

Tabela 1: Antígenos representativos de Borrelia utilizados para o desenvolvimento do ensaio multiplex.

Inicialmente, desenvolvemos um imunoensaio de repórter único que detectou anticorpos IgG ou IgM anti-antígeno de Borrelia em duas reações separadas e, em seguida, fundimos esses ensaios em um ensaio multiplex de repórter duplo que mede ambos os isotipos de anticorpos na mesma mistura de reação. As esferas magnéticas são acopladas a um antígeno alvo do patógeno de interesse e, em seguida, incubadas com amostras de soro do paciente. O antígeno acoplado ao grânulo é reconhecido e capta tanto a IgG quanto a IgM circulantes no soro que é gerado em uma resposta imune contra esse antígeno patogênico. A especificidade IgG versus IgM do ensaio é determinada pela seleção de um anticorpo secundário que se liga a IgG ou IgM, cada um com um sinal de fluoróforo distinto associado aos dois anticorpos secundários. Cada sinal fluorescente é detectado em um dos dois canais Reporter do instrumento (i.e., dual-reporter) que tem um laser de excitação diferente e captura de emissão específica para o único fluoróforo usado para detectar IgG ou IgM (aqui Brilliant Violet 421 ou ficoeritrina, respectivamente). O instrumento Canal de Classificação identifica o corante codificado por cores que é inerente a diferentes conjuntos de contas. Assim, múltiplos antígenos-alvo podem ser acoplados a esferas tingidas de forma diferente, e os conjuntos de esferas misturados e usados para avaliar de forma abrangente a imunorreatividade antipatogênica diversa em amostras de soro. O Canal de Classificação identifica cada conjunto de contas individual (ou seja, antígeno específico) e mede a fluorescência associada a IgG ou IgM contra esse antígeno. O ensaio multiplex resultante economiza tempo e recursos em comparação com testes clássicos menos abrangentes e cataloga com precisão a imunorreatividade de Lyme em volumes limitados de amostras. Considerando que uma abordagem similar do dual-reporter foi usada previamente para categorizar respostas imunes em outras patologias tais como a infecção SARS-CoV-2¹³, este relatório detalha a aplicação da tecnologia do ensaio fluorescente multiplex para caracterizar a imunorreactividade na borreliose de Lyme.

Protocol

Aprovação apropriada do Comitê de Ética e Comitê de Ética foi recebida para o uso de amostras de soro humano nesta série experimental. As amostras foram anonimizadas materiais residuais de um estudo nacional alemão da soroprevalência SARS-CoV-2¹⁴. A aprovação para o uso de amostras humanas foi concedida pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina de Hannover, Alemanha (9086_BO_S_2020). Um total de 21 amostras de soro humano foi utilizado no presente estudo.

1. Aprovação ética para o uso de amostras humanas

1. Obter aprovações éticas apropriadas para o uso de amostras humanas.

2. Reagentes e equipamentos

1. Amostras de soro humano: Realizar validação técnica de ensaio e controle de qualidade utilizando amostras de soro de pessoas previamente diagnosticadas com borreliose de Lyme ou de estado imunológico negativo para Borrelia demonstrado^12,14.
2. Instrumentação de Repórter Único. Use um instrumento de repórter único de dois canais (Tabela de Materiais) para o desenvolvimento inicial do ensaio e validação técnica.
   NOTA: O sistema de relatório único tem dois lasers: 1) identifica e quantifica a fluorescência específica do conjunto de contas para discriminar diferentes conjuntos de contas, se usado (Canal de Classificação), e 2) detecta e quantifica a fluorescência da ficoeritrina (PE) alvo-específica ligada ao grânulo (Canal do Repórter; excitação de 532 nm, emissão "laranja" de 565-585 nm). Assim, apenas uma única classe de isotipo de anticorpos (por exemplo, IgG ou IgM) pode ser analisada de uma só vez usando o único Canal do Repórter.
   1. Realizar estudos iniciais de validação para avaliar IgG e IgM anti-Borrelia separadamente, em um formato de 96 poços de relatório único que usa reagentes de detecção marcados com PE para ambas as classes de anticorpos.
      NOTA: O ensaio actual avalia IgGs circulantes específicas para o antígeno de Borrelia VlsE e duas variantes de DbpA, e IgM circulante específica para o antígeno OspC, como exemplos representativos. O ensaio pode ser expandido para avaliar a imunorreatividade sérica contra outros antígenos antiborrelia , conforme desejado¹².
3. Instrumentação Dual-Reporter. Utilizar um instrumento dual-reporter de três canais (Tabela de Materiais) que permite a análise simultânea de IgG/IgM na mesma reação, para o desenvolvimento e validação técnica do ensaio duplo IgM/IgG (detalhado abaixo). Este instrumento possui 3 canais de detecção de fluorescência total, dos quais 2 são canais Reporter que avaliam sinais associados a Ig direcionados.
   NOTA: O sistema dual-reporter possui três lasers: 1) identifica e quantifica a fluorescência específica do conjunto de contas (Canal de Classificação); 2) detecta e quantifica a fluorescência da ficoeritrina (PE) alvo-específica (Canal Repórter 1; excitação de 532 nm, emissão "laranja" de 565-585 nm) e 3) avalia a fluorescência alvo-específica do Brilliant Violet 421 (BV421) de um segundo analito alvo (Canal Repórter 2; excitação de 405 nm, emissão "azul" de 421-441 nm). O sistema dual-reporter é compatível com os formatos de ensaio de placa de microtitulação (manuseio semi-automatizado) de 96 e 384 poços. O esquema geral de ensaios é mostrado na Figura 1. As etapas do protocolo são detalhadas a seguir.

3. Acoplamento antigénio

1. Acoplar os antígenos de Borrelia a microesferas magnéticas, carboxiladas e fluorescentes codificadas por cores de 6,5μm (contas; Tabela de Materiais) usando química 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC)/sulfo-N-hidroxisuccinimida (sNHS).
   NOTA: Uma descrição detalhada pode ser encontrada na referência¹¹e na referência¹². Encontre a concentração de acoplamento de cada antígeno na Tabela 1. As esferas acopladas devem ser armazenadas no escuro a 4 °C até o uso. Todos os buffers utilizados nas reações de acoplamento e detecção estão detalhados nos Materiais Suplementares.

4. Procedimento de ensaio: Teste sorológico IgG ou IgM de repórter único: formato de 96 poços

1. Diluir a amostra em 2 etapas (2 etapas, ambas em placas de 96 poços; diluição da amostra de soro de 200 vezes em tampão de ensaio).
   NOTA: A composição do tampão de ensaio é uma mistura 1:4 de tampão cruzado baixo: PBS contendo 1% (p/v) de albumina de soro bovino. Tween-20 é adicionado à mistura até uma concentração final de 0,05 % (v/v).
   1. Etapa 1 de diluição da amostra: Misturar 5 μL da amostra de soro com 120 μL do tampão de ensaio (diluição de 25 vezes).
   2. Etapa 2 de diluição da amostra: Diluir adicionalmente 8 vezes a diluição da amostra de 25 vezes, misturando 10 μL da diluição com 70 μL do tampão de ensaio para tornar a diluição final da amostra em 200 vezes.
2. Diluição da mistura de esferas magnéticas
   1. Preparar uma mistura de contas contendo 1,0 × 10⁶ contas/mL por população de contas (ou seja, por antígeno alvo único).
   2. Diluir a mistura de contas preparada 25 vezes em tampão de ensaio para que a concentração final do cordão nesta suspensão diluída seja agora de 4 × 10⁴ contas/mL por população de contas (ou seja, por antígeno alvo único).
3. Incubação da amostra de soro com contas
   1. Pipetar 25 μL de suspensão de esferas multiplex acoplada diluída (contendo 4,0 × 10⁴ contas/conjunto/mL) em poços designados de uma placa de microtitulação de meia área de 96 poços (Tabela de Materiais).
   2. Adicionar 25 μL de amostra de soro diluída 200 vezes (do passo 4.1 acima) em poços apropriados contendo 25 μL de suspensão de esferas acopladas.
      NOTA: Isso produz uma diluição adicional de 2 vezes, de modo que a diluição final da amostra de soro no poço é de 400 vezes e a contagem final de contas é de 1000 contas/conjunto de contas/reação de 50 μL.
   3. Cubra a placa de reação de 96 poços com um selo de microplaca (folha adesiva ou tampas de placa plástica).
   4. Incubar a placa durante 2 h a 20 °C, a 750 rpm num agitador de placas.
4. Lavagem de contas
   1. Remova a placa de reação de 96 poços do agitador de placas e remova cuidadosamente o selo da placa adesiva.
   2. Coloque a placa de reação de 96 poços em uma lavadora de placas.
   3. Lavar as contas três vezes com tampão de lavagem de 100 μL (1× PBS + 0,05% v/v Tween 20) usando o lavador automático de placas magnéticas.
5. Ressuspenda as contas lavadas em 100 μL de tampão de lavagem, cubra a placa com folha adesiva ou tampa de placa plástica e agite a placa em um agitador de placa por 1 min a 20 °C a 1000 rpm.
6. Divida as contas lavadas
   1. Remova a placa de reação de 96 poços do agitador de placas e remova cuidadosamente o selo da placa adesiva.
   2. Misture as reações pipetando para cima e para baixo cinco vezes e transfira 50 μL de cada volume de reação de 100 μL para cada uma das duas novas placas de reação de 96 poços, uma placa para detecção de IgG e outra para detecção de IgM.
7. Incubação de anticorpos/reagentes de detecção
   NOTA: Neste ponto, as esferas acopladas ao antígeno alvo foram incubadas com amostras de soro para extrair anticorpos circulantes no soro (se presente) que reagem com o(s) antígeno(s). As esferas reagidas com imunoglobulina ligada foram divididas em duas placas, e IgG e IgM são agora detectadas e quantificadas em suas placas separadas usando anticorpos secundários isotipo-específicos com um rótulo de EP. Escalonamento do manuseio da placa por 20 min.
   1. Aspirar o sobrenadante dos poços contendo esferas magnéticas usando o lavador de placas magnéticas.
   2. Para cada placa, fazer a mistura apropriada de Reagente de Detecção de Ig (anti-IgG ou anti-IgM), contendo IgG de cabra anti-humano conjugado com PE (3 μg/mL) ou IgM anti-humano de burro conjugado com PE (5 μg/mL) no tampão de ensaio. Para cada talão contendo talão, são utilizados 30 μL de Reagente de Detecção. Prepare volumes suficientes de reagentes de detecção de IgG e IgM para poços de reação, com extra suficiente para acomodar perdas de pipetagem.
   3. Pipetar 30 μL de Reagente de Detecção de IgG em cada poço contendo esferas reagidas na placa de IgG e cobrir a placa de reação de 96 poços com um selo de microplaca.
   4. Pipetar 30 μL de Reagente de Detecção de IgM em cada poço contendo esferas reagidas na placa de IgM e cobrir a placa de reação de 96 poços com um selo de microplaca.
   5. Incubar durante 45 minutos a 20 °C enquanto agita a 750 rpm num agitador de placas.
8. Lavagem de contas
   1. Remova a placa de reação de 96 poços do agitador de placas e remova cuidadosamente o selo da placa adesiva.
   2. Coloque a placa de reação de 96 poços em uma arruela de placa magnética.
   3. Lave as contas três vezes com tampão de lavagem de 100 μL usando o lavador de placas magnéticas.
9. Ressuspenda as contas em 100 μL de tampão de lavagem.
10. Analise os resultados no instrumento de repórter único.
    1. Cubra a placa de reação de 96 poços com um selo de microplaca.
    2. Agitar a placa de reação de 96 poços por 3 min a 20 °C, a 1000 rpm em um agitador de placa.
    3. Transfira a placa de reação de 96 poços do agitador de placas e coloque em um instrumento analisador de fluxo de relatório único (Tabela de Materiais).
    4. Para cada amostra, analise a intensidade fluorescente mediana (MFI) usando as seguintes configurações do instrumento: Volume de captação = 80 μL, Contagem = 50/população de contas, Timeout = 60s, Gating = 7.500-15.000)^12,13.

5. Procedimento de ensaio: Teste sorológico de IgG e IgM de duplo repórter: formato de 96 poços

1. Diluição da amostra (2 etapas, ambas em placas de 96 poços; diluição da amostra de soro de 200 vezes em tampão de ensaio)
   1. Etapa 1 de diluição da amostra: Misturar 5 μL de amostra de soro com 120 μL de tampão de ensaio (diluição de 25 vezes).
   2. Etapa 2 de diluição da amostra: Diluir as diluições da amostra a 25 vezes mais 8 vezes misturando 10 μL da primeira diluição (amostra diluída em 25 vezes do ponto 5.1.1) com tampão de ensaio de 70 μL (diluição de 8 vezes), para obter a diluição final da amostra a 200 vezes.
2. Diluição da mistura de esferas magnéticas
   1. Preparar uma mistura de contas contendo 1,0 × 10⁶ contas acopladas a antígeno alvo/mL por população de contas (ou seja, por antígeno alvo único).
      NOTA: Nesta série experimental, avaliamos a imunorreatividade de IgG e IgM contra quatro antígenos únicos de Borrelia em cada reação.
   2. Diluir a mistura de contas preparada 50 vezes em tampão de ensaio. A concentração de esferas nesta suspensão diluída é agora de 2,0 × 10⁴ contas/mL por população de contas.
      NOTA: O número de contas na reação de ensaio duplex é reduzido pela metade daquele usado na reação de repórter único para permitir a comparabilidade direta entre os dois ensaios e conservar recursos, depois que estudos preliminares confirmaram que o sinal de fluorescência foi mantido dentro da faixa linear de quantificação ao usar metade do número de contas.
3. Incubação da amostra de soro com contas
   1. Pipetar 25 μL de suspensão de esferas diluídas acopladas a antígeno alvo (contendo 2,0 × 10⁴ contas/conjunto/mL) em poços pré-designados de uma placa de microtitulação de meia área de 96 poços. O número exato de poços de reação e sua colocação na placa dependem do número total de amostras testadas determinado pelo operador e se poços únicos ou replicados serão executados por amostra.
      NOTA: As esferas magnéticas acopladas ao antígeno alvo serão reagidas com amostras de soro humano. Tanto a IgG quanto a IgM imunorreativas ao antígeno antiborrelia , se presentes nas amostras, se ligarão e serão imobilizadas nas mesmas esferas acopladas ao antígeno. A quantificação de anticorpos secundários de IgG e IgM ligada será então realizada nas mesmas esferas nas mesmas reações, usando fluoróforos diferentes para identificação de IgG e IgM que permitam sua diferenciação.
   2. Adicionar 25 μL de soro diluído 200 vezes (do passo 5.1 acima) em cada poço contendo 25 μL de suspensão mista de esferas acopladas a antigénio alvo (passo 5.2).
      NOTA: Isso produz uma diluição adicional de 2 vezes, de modo que a diluição final da amostra de soro no poço é de 400 vezes, e a contagem final de contas é de 500 contas/conjunto de contas/reação de 50 μL.
   3. Cubra a placa de reação de 96 poços com um selo de microplaca (folha adesiva ou tampa de placa plástica).
   4. Incubar a placa com contas durante 2 h a 20 °C, a 750 rpm num agitador de placas.
4. Lavagem de contas (para remover o excesso de amostra de soro)
   1. Remova a placa de reação de 96 poços do agitador de placas e remova o selo da placa adesiva.
   2. Coloque a placa de reação de 96 poços em uma arruela de placa magnética.
   3. Lave as contas três vezes com tampão de lavagem de 100 μL usando o lavador de placas magnéticas.
5. Aspirar o volume final de lavagem das contas após a última etapa de lavagem.
6. Detecção de anticorpos (Incubação - Parte I)
   1. Fazer reagente de detecção dupla de IgG e IgM fresco contendo IgG biotinilado de cabra anti-humano (1 μg/mL) juntamente com IgM anti-humano de burro conjugado com PE (5 μg/mL) em tampão de ensaio. Para cada poço contendo talão, são utilizados 30 μL de Reagente de Detecção Dupla. Prepare volumes suficientes de reagentes de detecção dupla de IgG e IgM para poços de reação, com extra suficiente para acomodar perdas de pipetagem.
   2. Pipetar 30 μL de Reagente de Detecção Dupla de IgG e IgM em cada poço designado e cobrir a placa de reação de 96 poços com um selo de microplaca.
   3. Incubar a placa durante 45 minutos a 20 °C enquanto agita a 750 rpm num agitador de placas.
7. Lavagem de contas (para remover o excesso de anticorpos de detecção)
   1. Remova a placa de reação de 96 poços do agitador de placas e remova cuidadosamente o selo da placa adesiva.
   2. Coloque a placa de reação de 96 poços em uma lavadora de placas magnética automatizada.
   3. Lave as contas três vezes com tampão de lavagem de 100 μL usando o lavador de placas magnético automatizado.
8. Aspirar o volume final de lavagem das contas após a última etapa de lavagem.
9. Repórter conjugado com estreptavidina (Incubação - Parte II)
   1. Diluir a estreptavidina fresca marcada com BV421 em tampão de ensaio até uma concentração de 0,2 μg/ml. Para cada talão contendo talão, 30 μL de estreptavidina marcada com BV421 são usados. Prepare um volume suficiente de estreptavidina marcada com BV421 para poços de reação, com extra suficiente para acomodar perdas de pipetagem.
   2. Pipetar 30 μL de BV421-Streptavidin diluído em cada poço de reação e cobrir a placa de reação de 96 poços com o selo da microplaca.
   3. Incubar a placa durante 30 minutos a 20 °C enquanto agita a 750 rpm num agitador de placas.
10. Lavar contas (para remover o excesso BV421-Streptavidin)
    1. Remova a placa de reação de 96 poços do agitador de placas e remova cuidadosamente o selo da placa adesiva.
    2. Coloque a placa de reação de 96 poços na lavadora de placas magnéticas.
    3. Lave as contas três vezes com tampão de lavagem de 100 μL usando o lavador de placas magnético automatizado.
11. Ressuspenda as esferas dentro dos poços até um volume final de 100 μL em tampão de lavagem.
12. Analisar os resultados no instrumento dual-reporter
    1. Cubra a placa de reação de 96 poços com um selo de microplaca.
    2. Incubar a placa de reação de 96 poços por 3 min a 20 °C, a 1000 rpm em um agitador de placa.
    3. Transfira a placa de reação de 96 poços do agitador de placas para o instrumento analisador de fluxo de relatório duplo (Tabela de Materiais).
    4. Avaliar a intensidade fluorescente mediana (MFI) da amostra de acordo com as instruções do fabricante (Configurações do instrumento: Modo Dual-Reporter, Volume de captação = 80 μL, Contagem = 50/população de contas, Tempo limite = 60s, Gating = 7.500-15.000).

6. Teste sorológico duplo de IgG e IgM: formato semi-automatizado de 384 poços

1. Execute o ensaio de relatório duplo em formato de placa de 384 poços usando as etapas de ensaio detalhadas na seção 5, mas processe amostras usando um robô de pipetagem e uma lavadora de placas magnética automatizada (Tabela de Materiais). No formato de 384 poços, agite as placas durante incubações e lavagens a 1450 rpm e, antes de medir a fluorescência, agite a placa por 5 min a 21 °C e 1800 rpm.

Discussion

Este relato destaca o desenvolvimento de um imunoensaio de Borrelia baseado em contas de dois repórteres que determina de forma reprodutível e sensível a imunorreatividade anti-Borrelia em amostras de soro¹². As várias espécies patogênicas de Borrelia causadoras da borreliose de Lyme podem ser diferenciadas pela heterogeneidade antígeno-variante-específica 6,7,8,9. O ensaio multiplexado avalia simultaneamente a imunorreatividade anti-Borrelia mediada por IgG e IgM dentro da mesma reação, conservando assim reagentes, trabalho de parto e material de amostra de outra forma necessário para realizar dois ensaios singleplex separadamente. A comparação das respostas de IgM e IgG ao longo do tempo pode permitir um melhor acompanhamento da progressão da doença, uma vez que a soroconversão de IgM para IgG ocorre após a infecção⁶.

O sistema dual-reporter utiliza dois sistemas de anticorpos de detecção diferentes^13,15. Experimentos relacionados não demonstraram reatividade cruzada detectável significativa entre os sistemas de detecção de Borrelia anti-IgM e anti-IgG quando ambas as classes de anticorpos foram analisadas juntas no mesmo poço de reação¹². Considerando a menor afinidade de ligação dos anticorpos IgM versus IgG^16,17, escolhemos um anticorpo de detecção conjugado com PE para detecção de IgM (o primeiro canal repórter do instrumento dual-reporter) porque o EP é um dos fluoróforos emissores mais fortes rotineiramente utilizados em imunoensaios¹⁸. Para a avaliação de IgG, utilizou-se um anticorpo de detecção biotinilado que foi posteriormente iluminado com estreptavidina conjugada com BV421 (o segundo canal repórter do instrumento)¹⁹. Apesar da etapa adicional de incubação de 30 minutos em comparação com o sistema de repórter único, o sistema de repórter duplo produz o dobro de informações por reação. No geral, o ensaio multiplexado de repórter duplo requer menos tempo cumulativo e entradas de material do que a execução de dois ensaios de repórter único.

O forte desempenho e estabilidade do ensaio multiplexado de Borrelia foram exemplificados pela alta reprodutibilidade em estudos de precisão intra e interensaios, e pela demonstração de linearidade de diluição e paralelismo de diluição em uma ampla faixa de concentrações de amostra para avaliação de IgG e IgM. Observamos maiores níveis de emissão absoluta de fluorescência para os mesmos fluoróforos usando o instrumento de canal único versus o sistema de canal duplo (≈1,7× maiores com PE), atribuíveis a diferenças nas configurações ópticas e de calibração entre os dois instrumentos (Figura 4). No entanto, as curvas de emissão de fluorescência com ambos os fluoróforos permaneceram dentro da faixa linear de ambos os instrumentos nos extremos de diluição de amostra alta e baixa, e qualquer discrepância na fluorescência absoluta medida não afetou a classificação do status de exposição à Borrelia . ^12º

Uma grande vantagem deste ensaio multiplex de Borrelia baseado em esferas é a facilidade com que o ensaio pode ser modificado ou expandido para avaliar analitos diferentes ou adicionais, por exemplo, para detectar anticorpos contra antígenos de outras espécies de Borrelia . Os conjuntos de esferas magnéticas xMAP contêm diferentes combinações de corantes que podem ser distinguidas no Canal de Classificação do instrumento e podem teoricamente ser implementadas em ensaios multiplex que podem avaliar simultaneamente até 500 analitos únicos dentro da mesma amostra. Enquanto o estudo actual destaca quatro antígenos representativos de Borrelia para demonstrar a funcionalidade e a estabilidade do ensaio e para comparar o sistema do relatador único e duplo, o ensaio final interroga oito antígenos que juntos podem identificar todos os cinco patógenos da Borrelia clinicamente relevantes que circulam em toda a Europa e América do Norte¹².

O desempenho de alto rendimento é possível usando placas de microtitulação padrão de 384 poços em um formato de ensaio semi-automatizado. A compatibilidade do ensaio e do instrumento com placas de 96 e 384 poços permite que o ensaio multiplex de Borrelia seja usado como uma ferramenta de triagem eficiente para analisar rapidamente grandes conjuntos de amostras, como estudos nacionais²⁰. O desempenho manual do ensaio permanece possível para conjuntos de amostras menores usando placas menores de 96 poços.

As limitações do estudo incluem a avaliação comparativa de apenas alguns alvos de imunorreatividade à Borrelia em um pequeno número de amostras de soro humano. No entanto, o estudo original confirmou que o desempenho do ensaio para IgG e IgM foi mantido ao analisar oito antígenos de todas as cinco espécies conhecidas de Borrelia dentro de um conjunto de amostras maior¹². Além disso, o instrumento dual-reporter só pode avaliar dois isotipos de anticorpos simultaneamente dentro de cada reação, de modo que o perfil completo do isotipo exigiria a realização de reações de ensaio adicionais¹³.

Em conclusão, este relatório detalha a fusão e conversão bem-sucedidas de imunoensaios baseados em contas em ensaios de repórter duplo que podem avaliar simultaneamente anticorpos IgG e IgM patogênicos específicos para Borrelia em amostras de soro humano. Essa abordagem combinada economiza tempo total, material e mão de obra para gerar o mesmo volume de dados que dois ensaios independentes de um único repórter. O ensaio multiplex pode ser dimensionado do formato de placa de microtitulação de 96 poços a 384 poços e pode ser semi-automatizado pelo uso de placa robótica e instrumentação de manuseio de líquidos, tornando-o adequado para aplicações de alto rendimento, como grandes pesquisas populacionais. Sistemas de ensaio dual-reporter baseados em contas já demonstraram utilidade em avaliar, por exemplo, respostas imunes a outros patógenos virais e bacterianos^13,21, avaliar respostas de anticorpos alogênicos contra epítopos HLA em transplante de órgãos²² e explorar mecanismos de doença autoimune²³. O presente relatório detalhou o uso da tecnologia multiplex para identificar a exposição aos patógenos da Borrelia que causam a doença de Lyme, como um exemplo de como os laboratórios podem adaptar essa abordagem para explorar mecanismos imunológicos complexos em diversas patologias.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies and Detection Reagents	Source	Catalog Number
Biotinylated Goat Anti-Human IgG	Jackson ImmunoResearch (Dianova)	109-066-098
Brilliant Violet 421-Streptavidin	BD Biosciences	563259
Donkey Anti-Human IgM	Jackson ImmunoResearch (Dianova)	709-116-073
Borrelia Antigens	tgcBIOMICS (Bingen, Germany)
Coupling Reagents
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)	Thermo Scientific Pierce	77149 ProteoChem (100 mg)
10x PBS	Fisher Scientific	BP399-4
BSA	Carl Roth	T844.3
MES (2-ethanesulfonic acid; zwitterionic buffer)	Carl Roth	4256.2
Na2HPO4	Carl Roth	4984.1
ProClin300	Sigma	48914-U
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)	Thermo Scientific Pierce	24510 (500 mg)
Triton X-100	Thermo Scientific	85111
Instrumentation and Ancillary Lab Supplies	Source
384-well plate	Corning, Cat# 3570
96-well deep-well plates	ThermoFisher Scientific, Cat# 95040450
96-well half-area plates	Corning, Cat# 3690
BioTek 405 TS Plate Washer	BioTek Instruments/Agilent Technologies, Santa Clara, CA
BioTek MultiFlo FX Plate Washer	BioTek Instruments/Agilent Technologies, Santa Clara, CA
DynaMag Spin Magnet (for isolating beads in microcentrifuge tubes)	ThermoFisher, Cat# 12320D
Flexmap 3D (two-channel, single-reporter instrument)	Luminex Corp., Austin, TX
KingFisher Magnetic Particle Processor (for isolating beads in 96-well plates)	ThermoFisher, Cat# A31508
MagPlex Microspheres (magnetic, fluorescent, 6.5-µm-diameter beads)	Luminex Corp., Austin, TX
SmartBlock Plates	Eppendorf, Cat# 5363000039
ThermoMixer C	Eppendorf, Cat# 5382000015
ThermoTop	Eppendorf, Cat# 5308000003
xMAP Intelliflex (three-channel, dual-reporter instrument)	Luminex Corp., Austin, TX