대표 결과에 나타난 데이터 수집에 기여해 주신 Kellie Breen Church 박사님, Michael Kreisman 씨, Jessica Jang 씨께 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립보건원(NIH) R00 HD104994(R.B.M.)의 지원을 받았습니다.

모든 절차는 콜로라도 주립 대학(#3960)과 캘리포니아 대학 샌디에이고 기관 동물 관리 및 사용 위원회(S13235, PI Kellie Breen Church)의 승인을 받았습니다. 5마리의 성체 암컷과 2마리의 성체 수컷 C57/BL6 마우스(9-16주령)의 데이터가 대표 데이터 섹션에 묘사되어 있습니다. 암컷 마우스는 앞서 기술한 바와 같이 ICV 주사 및 채혈 3-4주 전에 난소 절제술을 하였다7. 실험 전에 이 쥐는 12시간...

Free-Hand Approach를 사용하여 마우스에서 뇌내 주사 수행

<ol>
	<li>Roseweir, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+potent+kisspeptin+antagonists+delineate+physiological+mechanisms+of+gonadotropin+regulation.">Discovery of potent kisspeptin antagonists delineate physiological mechanisms of gonadotropin regulation.</a> Journal of Neuroscience. 29 (12), 3920-3929 (2009).</li><li>Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebroventricular+viral+injection+of+the+neonatal+mouse+brain+for+persistent+and+widespread+neuronal+transduction.">Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51863 (2014).</li><li>Taylor, Z. V., Khand, B., Porgador, A., Monsonego, A., Eremenko, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+intracerebroventricular+injection+of+CD4(+)+T+cells+into+mice.">An optimized intracerebroventricular injection of CD4(+) T cells into mice.</a> STAR Protocols. 2 (3), 100725 (2021).</li><li>Russo, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+control+of+the+female+reproductive+axis+through+gated+responsiveness+of+the+RFRP-3+system+to+VIP+signaling.">Circadian control of the female reproductive axis through gated responsiveness of the RFRP-3 system to VIP signaling.</a> Endocrinology. 156 (7), 2608-2618 (2015).</li><li>Laursen, S. E., Belknap, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebroventricular+injections+in+mice.+Some+methodological+refinements.">Intracerebroventricular injections in mice. Some methodological refinements.</a> Journal of Pharmacological Methods. 16 (4), 355-357 (1986).</li><li>Haley, T. J., McCormick, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+effects+produced+by+intracerebral+injection+of+drugs+in+the+conscious+mouse.">Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse.</a> British Journal of Pharmacology and Chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).</li><li>McCosh, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-induced+hypoglycaemia+suppresses+pulsatile+luteinising+hormone+secretion+and+arcuate+Kiss1+cell+activation+in+female+mice.">Insulin-induced hypoglycaemia suppresses pulsatile luteinising hormone secretion and arcuate Kiss1 cell activation in female mice.</a> Journal of Neuroendocrinology. 31 (12), e12813 (2019).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation.">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> Bio-Protocol. 11 (5), e3988 (2021).</li><li>Comba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+glioma+subregions+for+spatial+and+molecular+characterization+of+intratumoral+heterogeneity,+oncostreams,+and+invasion.">Laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion.</a> Journal of Visual Experiments. (158), e60939 (2020).</li><li>Porteous, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reformulation+of+PULSAR+for+analysis+of+pulsatile+LH+secretion+and+a+revised+model+of+estrogen-negative+feedback+in+mice.">Reformulation of PULSAR for analysis of pulsatile LH secretion and a revised model of estrogen-negative feedback in mice.</a> Endocrinology. 162 (11), (2021).</li><li>Hohmann, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+role+of+melanocortins+in+mediating+leptin's+central+effects+on+feeding+and+reproduction.">Differential role of melanocortins in mediating leptin's central effects on feeding and reproduction.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 278 (1), R50-R59 (2000).</li><li>Gottsch, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+kisspeptins+in+the+regulation+of+gonadotropin+secretion+in+the+mouse.">A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse.</a> Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).</li><li>Krasnow, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+galanin-like+peptide+in+the+integration+of+feeding,+body+weight+regulation,+and+reproduction+in+the+mouse.">A role for galanin-like peptide in the integration of feeding, body weight regulation, and reproduction in the mouse.</a> Endocrinology. 144 (3), 813-822 (2003).</li></ol>

여기에서, 마우스에서 ICV 주사를 만들기 위한 간단하고 효과적인 수단이 설명된다. 이 기술은 입체 구조를 필요로 하지 않기 때문에 약물 및 실험 제제의 중앙 전달을 위한 이 접근 방식은 더 많은 연구자가 접근할 수 있습니다. 또한 이 접근 방식은 준비 및 주입 절차를 신속하게 수행할 수 있기 때문에 처리량이 상대적으로 높습니다.
이 시술은 대략적인 거리를 사용하여 바?...

약물1, 바이러스2 또는 세포3와 같은 실험 물질의 뇌 전달은 종종 신경내분비 연구에 필요하다. 약제가 혈액뇌장벽을 쉽게 통과하지 못하거나 실험 목적이 약제의 중심 효과를 구체적으로 테스트하는 것이라면 뇌에 주사를 전달하는 신뢰할 수 있는 방법을 갖는 것이 중요합니다. 또한, 뇌내(ICV) 공간으로의 주입은 약제를 뇌에 널리 분포시킬 수 있는 기회를 제공하고 넓은 표적 영역을 제공하므로 성공적인 주입 가능성을 높인다2.
ICV 주사를 만드는 일반적인 방법에는 영구 유치 캐뉼라를 배치하는 것이 포함됩니다. 이 접근법에서, 캐뉼라가 제자리에 접착되거나 접합되기 때문에, 상업적으로 이용 가능한 또는 주문형 캐뉼라를 배치하기 위해 입체 프레임 (stereotaxic frame)이 필요하다. 종종 회복 시 안지오텐신 II의 초생리학적 용량이 캐뉼라를 통해 투여되며, 음주 행동이 즉시 관찰되면 캐뉼라가 올바르게 배치된 것으로 간주된다4. 이 접근 방식은 장기 주입을 수행할 수 있는 능력과 동일한 동물을 여러 번 주입할 수 있는 능력을 포함하여 많은 장점이 있습니다. 또한, 안지오텐신 II를 사용하는 경우, 실험 화합물을 투여하기 전에 올바른 배치를 확인할 수 있습니다. 그러나 영구 캐뉼라를 배치하는 데에는 고가의 장비(입체 프레임)에 대한 요구 사항, 배치 후 캐뉼라가 손상될 가능성(예: 쥐가 케이지 메이트의 캐뉼라를 씹을 수 있음) 및 영구 캐뉼라 주변의 감염 가능성을 포함하여 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 단일 ICV 주사는 입체탁스 프레임(stereotaxic frame)3을 사용하여 이루어질 수 있는데, 이는 효과적이기는 하지만, 마취에 대한 상당한 노출을 필요로 하며, 따라서 치료의 일부 급성 생리학적 및 행동적 효과를 모호하게 할 수 있다. 또한, 입체 프레임에 마우스를 배치하려면 안정적인 배치를 달성하고 외이도의 파열을 방지하기 위해 상당한 훈련이 필요합니다.
여기에서, 마우스에서 프리-핸드 주사를 하기 위한 확립된 방법이 설명된다. 이 방법은 이전 보고서 5,6을 기반으로 합니다. 이 기술의 장점은 간단하고 빠르며 입체 프레임과 같은 특수 장비가 필요하지 않다는 것입니다. 후술하는 바와 같이, 이 시술은 주사를 만들기 위해 마우스 헤드의 랜드마크에 대해 유리 주사기를 조작하는 것을 포함하며, 이는 신속하게 수행될 수 있으므로 실험 당일에 몇 분의 가스 마취만 필요합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18-gauge blunt needles</td>
			<td>SAI Infusion</td>
			<td>B18-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18-gauge needles</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol pads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench pad</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-206-62AC22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1696484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Patterson Vet Supply</td>
			<td>07-892-5235</td>
			<td>Controlled substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyelube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-218-8442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7634-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-01</td>
			<td>27 gauge, Small Hub RN needle, point style: 4, Needle length: 10cm, Angle: 45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane&#160;&#160;</td>
			<td>Patterson Vet Supply</td>
			<td>07-893-8441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer</td>
			<td>Vet Equip</td>
			<td>V-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89098-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical grade oxygen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>OX USPEA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>8.18715.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>J67802.K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PulsaR Software</td>
			<td>Open source, University of Otago</td>
			<td></td>
			<td>See ref 9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ruler</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-00-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silastic tubing (0.040&#34; I.D.)</td>
			<td>DOW</td>
			<td>508-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silastic tubing (0.078&#34; I.D.)</td>
			<td>DOW</td>
			<td>508-009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile saline</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101320-574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

free-hand intracerebroventricular injections in mice

신경 내분비계를 조사하려면 종종 약물, 바이러스 또는 기타 실험 물질을 쥐의 뇌에 직접 전달해야 합니다. 뇌내 심실(ICV) 주사는 뇌 전체(특히 심실 근처의 구조)에 실험 물질을 광범위하게 전달할 수 있습니다. 여기에서, 성체 마우스에서 프리-핸드 ICV 주사를 하는 방법을 설명한다. 쥐의 머리에 시각 및 촉각 랜드마크를 사용하여 측실에 빠르고 안정적으로 주입할 수 있습니다. 주사는 실험자의 손에 들린 유리 주사기로 이루어지며 랜드마크에서 대략적인 거리에 배치됩니다. 따라서 이 기술에는 입체 프레임 이 필요하지 않습니다. 또한, 이 기술은 잠깐의 이소플루란 마취만을 필요로 하며, 이는 깨어 있고 자유롭게 행동하는 마우스에서 마우스 행동 및/또는 생리학의 후속 평가를 허용합니다. 자유형 ICV 주사는 살아있는 쥐의 뇌에 실험 물질을 효율적으로 전달하기 위한 강력한 도구이며 빈번한 혈액 샘플링, 신경 회로 조작 또는 신경 내분비 과정을 조사하기 위한 생체 내 기록과 같은 다른 기술과 결합할 수 있습니다.

The delivery of experimental agents, such as drugs1, viruses2, or cells3, to the brain is often necessary for neuroendocrine research. If the agent does not readily cross the blood-brain barrier or the experimental objective is to specifically test the central effects of the agent, it is important to have a reliable method for delivering injections into the brain. Moreover, injection into the intracerebroventricular (ICV) space provides the opportunity to distribute the agent widely in the brain and provides a large target area, thus increasing the likelihood of successful injection2. 
A common method for making ICV injections involves the placement of a permanent indwelling cannula. In this approach, a stereotaxic frame is necessary to position the commercially available or custom-made cannula, as the cannula is glued or cemented in place. Often, upon recovery, a supraphysiological dose of angiotensin II is administered through the cannula, and if drinking behavior is immediately observed, then the cannula is considered correctly placed4. This approach has many advantages, including the ability to perform long-term infusion and the ability to inject the same animal multiple times; additionally, if angiotensin II is employed, correct placement can be confirmed prior to the administration of experimental compounds. However, there are some limitations to placing a permanent cannula, including the requirement for expensive equipment (stereotaxic frame), the possibility of damage to the cannula after placement (e.g., mice can chew on the cannula of a cage mate), and the possibility of infections around the permanent cannula. Single ICV injections can be made with the use of a stereotaxic frame3, which, although effective, requires substantial exposure to anesthesia and, thus, may obscure some acute physiological and behavioral effects of the treatment. Additionally, the placement of mice in a stereotaxic frame requires substantial training to achieve stable placement and prevent the rupturing of the ear canals.
Here, an established method for making free-hand injections in mice is described. This method is based on previous reports5,6. The advantages of this technique are that it is simple, rapid, and does not require specialized equipment such as a stereotaxic frame. As described below, this procedure involves manipulating a glass syringe relative to landmarks on the mouse head to make the injections, which can be done rapidly and, thus, requires only a few minutes of gas anesthesia on the experimental day.

저자 스포트라이트: 생식 신경 조절의 통찰력, 혁신 및 미래 방안 

Free-Hand Intracerebroventricular Injections in Mice

We are interested in the neural control of reproductive function, particularly how the brain regulates the release of hormones that control the gonads, both in healthy conditions and in response to stress. The main advantage of this technique is that it is relatively simple and rapid. Delivering drugs into the lateral ventricle is a great way to cast a wide net in testing a signaling pathway to support more detailed follow-up experiments.There's still much to be learned about the neuroendocrine control of reproduction, including the molecular mechanisms for luteinizing hormone pulse generation, mechanisms for modulating pulse frequency during stress, and generation of the preovulatory LH surge. In the future, we are particularly interested in integrating disparate findings into models.

성공적으로 수행되면 이 기술은 실험 제제를 심실 시스템에 신속하게 전달할 수 있습니다. 많은 약리학적 화합물의 매개체인 멸균 등장성 식염수 3μL의 ICV 주사를 받은 난소 절제술 마우스의 황체 형성 호르몬(LH) 펄스 프로파일이 그림 2A에 나와 있습니다. 이 예는 가스 마취에 잠깐 노출되고 심실계에 3μL의 유체를 주입하는 것만으로는 박동성 LH 분비가 변하지 않는다는 것?...

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여기에서, 자유형 접근법(즉, 입체적 장치 없이)을 사용하여 마우스에서 뇌내주사를 수행하기 위한 간단하고 신속한 접근법이 설명된다.

The investigation of neuroendocrine systems often requires the delivery of drugs, viruses, or other experimental agents directly into the brains of mice. ...

우리는 생식 기능의 신경 조절, 특히 건강한 상태와 스트레스에 대한 반응 모두에서 뇌가 생식선을 조절하는 호르몬의 방출을 조절하는 방법에 관심이 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 비교적 간단하고 빠르다는 것입니다. 측심실에 약물을 전달하는 것은 보다 자세한 후속 실험을 지원하기 위해 신호 전달 경로를 테스트하는 데 광범위한 그물을 던질 수 있는 좋은 방법입니다.황체 형성 호르몬 맥박 생성을 위한 분자 메커니즘, 스트레스 중 맥박 주파수를 조절하는 메커니즘, 배란 전 LH 급증 생성 등 생식의 신경 내분비 조절에 대해 아직 배워야 할 것이 많습니다. 앞으로 우리는 서로 다른 결과를 모델에 통합하는 데 특히 관심이 있습니다.

Free-Hand Intracerebroventricular Injections in Mice

Abstract