Vi vill tacka Dr. Kellie Breen Church, Mr. Michael Kreisman och Ms. Jessica Jang för deras bidrag till att samla in data som visas i de representativa resultaten. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) R00 HD104994 (R.B.M.).

Alla procedurer godkändes av Colorado State University (#3960) och University of California San Diego Institutional Animal Care and Use Committees, där representativa data samlades in (S13235, PI Kellie Breen Church). Data från fem vuxna honmöss och två vuxna hanmöss av typen C57/BL6 (9-16 veckor gamla) visas i avsnittet med representativa uppgifter. Honmöss ovariektomerades 3-4 veckor före ICV-injektion och blodinsamling som beskrivits tidigare7. Före experimentet hölls dessa möss med ...

Utföra intracerebroventrikulär injektion på möss med hjälp av en frihandsmetod

<ol>
	<li>Roseweir, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+potent+kisspeptin+antagonists+delineate+physiological+mechanisms+of+gonadotropin+regulation.">Discovery of potent kisspeptin antagonists delineate physiological mechanisms of gonadotropin regulation.</a> Journal of Neuroscience. 29 (12), 3920-3929 (2009).</li><li>Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebroventricular+viral+injection+of+the+neonatal+mouse+brain+for+persistent+and+widespread+neuronal+transduction.">Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51863 (2014).</li><li>Taylor, Z. V., Khand, B., Porgador, A., Monsonego, A., Eremenko, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+intracerebroventricular+injection+of+CD4(+)+T+cells+into+mice.">An optimized intracerebroventricular injection of CD4(+) T cells into mice.</a> STAR Protocols. 2 (3), 100725 (2021).</li><li>Russo, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+control+of+the+female+reproductive+axis+through+gated+responsiveness+of+the+RFRP-3+system+to+VIP+signaling.">Circadian control of the female reproductive axis through gated responsiveness of the RFRP-3 system to VIP signaling.</a> Endocrinology. 156 (7), 2608-2618 (2015).</li><li>Laursen, S. E., Belknap, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebroventricular+injections+in+mice.+Some+methodological+refinements.">Intracerebroventricular injections in mice. Some methodological refinements.</a> Journal of Pharmacological Methods. 16 (4), 355-357 (1986).</li><li>Haley, T. J., McCormick, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+effects+produced+by+intracerebral+injection+of+drugs+in+the+conscious+mouse.">Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse.</a> British Journal of Pharmacology and Chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).</li><li>McCosh, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-induced+hypoglycaemia+suppresses+pulsatile+luteinising+hormone+secretion+and+arcuate+Kiss1+cell+activation+in+female+mice.">Insulin-induced hypoglycaemia suppresses pulsatile luteinising hormone secretion and arcuate Kiss1 cell activation in female mice.</a> Journal of Neuroendocrinology. 31 (12), e12813 (2019).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation.">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> Bio-Protocol. 11 (5), e3988 (2021).</li><li>Comba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+glioma+subregions+for+spatial+and+molecular+characterization+of+intratumoral+heterogeneity,+oncostreams,+and+invasion.">Laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion.</a> Journal of Visual Experiments. (158), e60939 (2020).</li><li>Porteous, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reformulation+of+PULSAR+for+analysis+of+pulsatile+LH+secretion+and+a+revised+model+of+estrogen-negative+feedback+in+mice.">Reformulation of PULSAR for analysis of pulsatile LH secretion and a revised model of estrogen-negative feedback in mice.</a> Endocrinology. 162 (11), (2021).</li><li>Hohmann, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+role+of+melanocortins+in+mediating+leptin's+central+effects+on+feeding+and+reproduction.">Differential role of melanocortins in mediating leptin's central effects on feeding and reproduction.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 278 (1), R50-R59 (2000).</li><li>Gottsch, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+kisspeptins+in+the+regulation+of+gonadotropin+secretion+in+the+mouse.">A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse.</a> Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).</li><li>Krasnow, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+galanin-like+peptide+in+the+integration+of+feeding,+body+weight+regulation,+and+reproduction+in+the+mouse.">A role for galanin-like peptide in the integration of feeding, body weight regulation, and reproduction in the mouse.</a> Endocrinology. 144 (3), 813-822 (2003).</li></ol>

Här beskrivs ett enkelt och effektivt sätt att göra ICV-injektioner i möss. Eftersom denna teknik inte kräver en stereotaktisk ram, är detta tillvägagångssätt för central leverans av läkemedel och experimentella medel tillgängligt för fler forskare. Dessutom är detta tillvägagångssätt relativt högt genomströmning eftersom berednings- och injektionsproceduren kan utföras snabbt.
Eftersom denna procedur kräver manipulering av nålar och en glasspruta för hand med ungefärli...

Leverans av experimentella ämnen, såsom läkemedel1, virus2 eller celler3, till hjärnan är ofta nödvändigt för neuroendokrin forskning. Om medlet inte lätt passerar blod-hjärnbarriären eller om det experimentella målet är att specifikt testa de centrala effekterna av medlet, är det viktigt att ha en tillförlitlig metod för att leverera injektioner i hjärnan. Dessutom ger injektion i det intracerebroventrikulära (ICV) utrymmet möjlighet att distribuera medlet brett i hjärnan och ger ett stort målområde, vilket ökar sannolikheten för framgångsrik injektion2. 
En vanlig metod för att göra ICV-injektioner är att placera en permanent kvarliggande kanyl. I detta tillvägagångssätt är en stereotaktisk ram nödvändig för att positionera den kommersiellt tillgängliga eller specialtillverkade kanylen, eftersom kanylen limmas eller cementeras på plats. Ofta, vid återhämtning, administreras en suprafysiologisk dos av angiotensin II genom kanylen, och om dryckesbeteende omedelbart observeras, anses kanylen vara korrekt placerad4. Detta tillvägagångssätt har många fördelar, bland annat möjligheten att utföra långvarig infusion och möjligheten att injicera samma djur flera gånger. Dessutom, om angiotensin II används, kan korrekt placering bekräftas före administrering av experimentella substanser. Det finns dock vissa begränsningar för att placera en permanent kanyl, inklusive kravet på dyr utrustning (stereotaktisk ram), risken för skador på kanylen efter placering (t.ex. kan möss tugga på kanylen på en burkamrat) och risken för infektioner runt den permanenta kanylen. Enstaka ICV-injektioner kan göras med hjälp av en stereotaktisk ram3, som, även om den är effektiv, kräver betydande exponering för anestesi och därmed kan dölja vissa akuta fysiologiska och beteendemässiga effekter av behandlingen. Dessutom kräver placeringen av möss i en stereotaktisk ram omfattande träning för att uppnå stabil placering och förhindra att hörselgångarna brister.
Här beskrivs en etablerad metod för att göra frihandsinjektioner i möss. Denna metod är baserad på tidigare rapporter 5,6. Fördelarna med denna teknik är att den är enkel, snabb och inte kräver specialutrustning som en stereotaktisk ram. Som beskrivs nedan innebär denna procedur att man manipulerar en glasspruta i förhållande till landmärken på mushuvudet för att göra injektionerna, vilket kan göras snabbt och därför kräver endast några minuters gasbedövning på experimentdagen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18-gauge blunt needles</td>
			<td>SAI Infusion</td>
			<td>B18-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18-gauge needles</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol pads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench pad</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-206-62AC22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1696484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Patterson Vet Supply</td>
			<td>07-892-5235</td>
			<td>Controlled substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyelube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-218-8442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7634-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-01</td>
			<td>27 gauge, Small Hub RN needle, point style: 4, Needle length: 10cm, Angle: 45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane&#160;&#160;</td>
			<td>Patterson Vet Supply</td>
			<td>07-893-8441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer</td>
			<td>Vet Equip</td>
			<td>V-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89098-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical grade oxygen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>OX USPEA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>8.18715.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>J67802.K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PulsaR Software</td>
			<td>Open source, University of Otago</td>
			<td></td>
			<td>See ref 9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ruler</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-00-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silastic tubing (0.040&#34; I.D.)</td>
			<td>DOW</td>
			<td>508-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silastic tubing (0.078&#34; I.D.)</td>
			<td>DOW</td>
			<td>508-009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile saline</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101320-574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

free-hand intracerebroventricular injections in mice

Undersökningen av neuroendokrina system kräver ofta leverans av läkemedel, virus eller andra experimentella medel direkt in i hjärnan hos möss. En injektion av intracerebroventrikulär (ICV) gör det möjligt att i stor utsträckning leverera det experimentella medlet i hela hjärnan (särskilt i strukturerna nära kamrarna). Här beskrivs metoder för att göra ICV-injektioner på fri hand hos vuxna möss. Genom att använda visuella och taktila landmärken på mössens huvuden kan injektioner i de laterala ventriklarna göras snabbt och tillförlitligt. Injektionerna görs med en glasspruta som hålls i försöksledarens hand och placeras på ungefärligt avstånd från landmärkena. Således kräver denna teknik inte en stereotaktisk ram. Dessutom kräver denna teknik endast kortvarig isoflurananebedövning, vilket möjliggör efterföljande bedömning av musbeteende och/eller fysiologi hos vakna möss som beter sig fritt. ICV-injektion på fri hand är ett kraftfullt verktyg för effektiv leverans av experimentella medel till hjärnan hos levande möss och kan kombineras med andra tekniker som frekvent blodprovstagning, manipulation av neurala kretsar eller in vivo-inspelning för att undersöka neuroendokrina processer.

The delivery of experimental agents, such as drugs1, viruses2, or cells3, to the brain is often necessary for neuroendocrine research. If the agent does not readily cross the blood-brain barrier or the experimental objective is to specifically test the central effects of the agent, it is important to have a reliable method for delivering injections into the brain. Moreover, injection into the intracerebroventricular (ICV) space provides the opportunity to distribute the agent widely in the brain and provides a large target area, thus increasing the likelihood of successful injection2. 
A common method for making ICV injections involves the placement of a permanent indwelling cannula. In this approach, a stereotaxic frame is necessary to position the commercially available or custom-made cannula, as the cannula is glued or cemented in place. Often, upon recovery, a supraphysiological dose of angiotensin II is administered through the cannula, and if drinking behavior is immediately observed, then the cannula is considered correctly placed4. This approach has many advantages, including the ability to perform long-term infusion and the ability to inject the same animal multiple times; additionally, if angiotensin II is employed, correct placement can be confirmed prior to the administration of experimental compounds. However, there are some limitations to placing a permanent cannula, including the requirement for expensive equipment (stereotaxic frame), the possibility of damage to the cannula after placement (e.g., mice can chew on the cannula of a cage mate), and the possibility of infections around the permanent cannula. Single ICV injections can be made with the use of a stereotaxic frame3, which, although effective, requires substantial exposure to anesthesia and, thus, may obscure some acute physiological and behavioral effects of the treatment. Additionally, the placement of mice in a stereotaxic frame requires substantial training to achieve stable placement and prevent the rupturing of the ear canals.
Here, an established method for making free-hand injections in mice is described. This method is based on previous reports5,6. The advantages of this technique are that it is simple, rapid, and does not require specialized equipment such as a stereotaxic frame. As described below, this procedure involves manipulating a glass syringe relative to landmarks on the mouse head to make the injections, which can be done rapidly and, thus, requires only a few minutes of gas anesthesia on the experimental day.

Författare i fokus: Insikter, innovationer och framtida vägar inom reproduktiv neurokontroll 

Intracerebroventrikulära injektioner på fri hand hos möss

We are interested in the neural control of reproductive function, particularly how the brain regulates the release of hormones that control the gonads, both in healthy conditions and in response to stress. The main advantage of this technique is that it is relatively simple and rapid. Delivering drugs into the lateral ventricle is a great way to cast a wide net in testing a signaling pathway to support more detailed follow-up experiments.There's still much to be learned about the neuroendocrine control of reproduction, including the molecular mechanisms for luteinizing hormone pulse generation, mechanisms for modulating pulse frequency during stress, and generation of the preovulatory LH surge. In the future, we are particularly interested in integrating disparate findings into models.

När den utförs framgångsrikt möjliggör denna teknik snabb leverans av ett experimentellt medel in i ventrikelsystemet. En pulsprofil för luteiniserande hormon (LH) från en ovariektomerad mus som fick en ICV-injektion av 3 μL steril isoton koksaltlösning, vehikel för många farmakologiska föreningar, visas i figur 2A. Detta exempel visar att kortvarig exponering för gasanestesi och injektion av 3 μL vätska i ventrikelsystemet ensamt inte förändrade den pulserande LH-sekretione...

Watch this Scientific Journal Video about Insights, Innovations, and Future Avenues in Reproductive Neurocontrol at JoVE.com

Här beskrivs ett enkelt och snabbt tillvägagångssätt för att utföra intracerebroventrikulära injektioner på möss med hjälp av en frihandsmetod (det vill säga utan en stereotaktisk enhet).

The investigation of neuroendocrine systems often requires the delivery of drugs, viruses, or other experimental agents directly into the brains of mice. ...

Vi är intresserade av den neurala kontrollen av reproduktionsfunktionen, särskilt hur hjärnan reglerar frisättningen av hormoner som styr könskörtlarna, både under friska förhållanden och som svar på stress. Den största fördelen med denna teknik är att den är relativt enkel och snabb. Att leverera läkemedel in i den laterala ventrikeln är ett utmärkt sätt att kasta ett brett nät för att testa en signalväg för att stödja mer detaljerade uppföljningsexperiment.Det finns fortfarande mycket att lära om den neuroendokrina kontrollen av reproduktion, inklusive de molekylära mekanismerna för generering av luteiniserande hormonpuls, mekanismer för att modulera pulsfrekvensen under stress och generering av den preovulatoriska LH-ökningen. I framtiden är vi särskilt intresserade av att integrera olika resultat i modeller.

Intracerebroventrikulära injektioner på fri hand hos möss

Abstract