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Summary

यहां, प्रकाशिकी-आधारित मंच का उपयोग करके मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स में संकुचन और कैल्शियम माप करने के लिए एक स्थापित विधि का वर्णन किया गया है। यह मंच शोधकर्ताओं को उत्परिवर्तन के प्रभाव और विभिन्न उत्तेजनाओं की प्रतिक्रिया का तेजी से और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से अध्ययन करने में सक्षम बनाता है।

Abstract

मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (एचआईपीएस-सीएम) कार्डियोमायोसाइट्स फ़ंक्शन में उत्परिवर्तन-मध्यस्थता परिवर्तनों का अध्ययन करने और तनाव और दवा हस्तक्षेप के प्रभावों को परिभाषित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं। इस अध्ययन में, यह प्रदर्शित किया गया है कि यह प्रकाशिकी-आधारित प्रणाली 2 डी में एचआईपीएस-सीएम के कार्यात्मक मापदंडों का आकलन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। इस प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग करके, विभिन्न प्लेट लेआउट पर एक अच्छी तरह से संरक्षित तापमान वातावरण में युग्मित माप करना संभव है। इसके अलावा, यह प्रणाली शोधकर्ताओं को तत्काल डेटा विश्लेषण प्रदान करती है।

यह पेपर असंशोधित HIPSC-CM की संविदात्मकता को मापने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। संकुचन कैनेटीक्स को 250 हर्ट्ज नमूना आवृत्ति पर विश्राम पर लिए गए संदर्भ फ्रेम के सापेक्ष पिक्सेल सहसंबंध परिवर्तनों के आधार पर 37 डिग्री सेल्सियस पर मापा जाता है। इसके अतिरिक्त, इंट्रासेल्युलर कैल्शियम क्षणिकों के एक साथ माप को कैल्शियम-संवेदनशील फ्लोरोफोरे के साथ सेल को लोड करके प्राप्त किया जा सकता है, जैसे कि फुरा -2। हाइपरस्विच का उपयोग करके, अनुपातमीट्रिक कैल्शियम माप को 50 μm व्यास रोशनी स्थान पर किया जा सकता है, जो अनुबंध माप के क्षेत्र के अनुरूप है।

Introduction

दिल की विफलता दुनिया भर में मौत का प्रमुख कारण है। 2019 में, कार्डियोवैस्कुलर बीमारी ने विश्व स्तर पर 18.6 मिलियन मौतों का कारण बना, जोपिछले दशक 1 में 17.1% की वृद्धि को दर्शाता है। दिल की विफलता को रोकने और ठीक करने के लिए दवा लक्ष्यों की पहचान करने के शोधकर्ताओं के प्रयासों के बावजूद, रोगी के परिणाम अभीभी खराब हैं। मनुष्यों के संबंध में पशु मॉडल के पैथोफिज़ियोलॉजी में अंतर दिल कीविफलता चिकित्सा के अनुकूलन के लिए सीमित सफलता में अंतर्निहित कारकों में से एक हो सकता है। अतिरिक्त मानव-जैसे मॉडल को बीमारी के मॉडल और नए दवा यौगिकों की विषाक्तता और प्रभावशीलता का परीक्षण करने के लिए वारंट किया जाता है।

मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (एचआईपीएस-सीएम) तनाव, इस्किमिया, परिवर्तित चयापचय, या रोगजनक जीन वेरिएंट औरदवा हस्तक्षेप की प्रभावशीलता और विषाक्तता से प्रेरित सेलुलर पैथोमैकेनिज्म को परिभाषित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं। एचआईपीएस-सीएम के कार्यात्मक गुणों पर प्रभाव को परिभाषित करने के लिए, एक उच्च गति प्रणाली जो एक निष्पक्ष और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से सेलुलर संकुचन के सिस्टोलिक और डायस्टोलिक गुणों को मापती है। वर्तमान अध्ययन का यह समग्र लक्ष्य यह प्रदर्शित करना है कि एक प्रकाशिकी-आधारित प्रणाली एचआईपीएस-सीएम के कार्यात्मक मापदंडों के वास्तविक समय के विश्लेषण करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।

वर्तमान में, HIPSC-CM के अनुबंध का मूल्यांकन करने के लिए कई प्लेटफ़ॉर्म हैं। हालांकि, वर्तमान सिस्टम या तो धीमी गति से रीडआउट प्रदान करते हैं, या कोशिकाओं की आवश्यक संख्या एक चुनौती हो सकती है। लेबल-मुक्त वीडियो माप प्रणाली5,6 वीडियो के पोस्ट-हॉक विश्लेषण पर भरोसा करती है, जिसके लिए बहुत अधिक भंडारण की आवश्यकता होती है और वीडियो अधिग्रहण के दौरान प्रत्यक्ष प्रतिक्रिया का अभाव होता है। इसके अलावा, पर्याप्त अस्थायी और स्थानिक संकल्प प्राप्त करना कठिन है, और इसके परिणामस्वरूप अंडरसैंपलिंग हो सकती है। कार्डियोमायोसाइट्स गुणों को निर्धारित करने के अन्य तरीके, जैसे कि फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स के साथ नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट (सीआरआईएसपीआर)/सीएएस 9-संपादित एचआईपीएस-सीएम7 कोशिकाओं की जीन स्थिरता में हस्तक्षेप कर सकते हैं और विशेष प्रयोगशाला विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है।

ऊपर उल्लिखित सीमाओं को दूर करने के लिए, इस अध्ययन में एक अद्वितीय प्रकाशिकी-आधारित माप प्रणाली विकसित और पेश की गई थी। यह प्लेटफ़ॉर्म प्लेट आकार में किसी भी सीमा के बिना, किसी भी आवश्यक प्लेट प्रारूप पर उन्हें रीप्लेट करके असंशोधित एचआईपीएस-सीएम पर अनुबंध माप को सक्षम बनाता है। इसके अलावा, वास्तविक समय माप HIPSC-CM के कार्यात्मक मापदंडों के प्रत्यक्ष अवलोकन और विश्लेषण की अनुमति देते हैं, और इस प्रकार प्रोटोकॉल को तुरंत समायोजित और अनुकूलित करने के लिए एक प्रयोगात्मक सेटिंग प्रदान करते हैं। इसके अलावा, प्रत्येक माप का स्थान संग्रहीत किया जाता है, जो एक ही नमूने पर युग्मित माप को सक्षम करता है, जिससे प्रयोगों की शक्ति बढ़ जाती है।

प्रकाशिकी-आधारित प्रणाली का प्रदर्शन करने के लिए, अनुबंध माप एक नियंत्रण HIPSC-CM लाइन पर किया गया था। यह नियंत्रण एचआईपीएस लाइन एक सामान्य कैरियोटाइप8 के साथ एक स्वस्थ पुरुष दाता के त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट से उत्पन्न हुई थी। संकुचन कैनेटीक्स को 37 डिग्री सेल्सियस पर मापा गया था, जो 250 हर्ट्ज नमूना आवृत्ति पर विश्राम के दौरान लिए गए संदर्भ फ्रेम के सापेक्ष पिक्सेल सहसंबंध परिवर्तनों पर आधारित था। चूंकि संकुचन की सटीक शुरुआत हमेशा स्पष्ट रूप से निर्धारित नहीं की जा सकती है, जिस समय बिंदु पर शिखर ऊंचाई का 20% (समय से शिखर 20%) तक पहुंच गया था, उसे चरम पर समय के माप के लिए शुरुआती बिंदु के रूप में लिया गया था। ऐसा करने से, एक नमूने के भीतर इस पैरामीटर के लिए कम परिवर्तनशीलता पाई गई। इसी तरह, जैसा कि सटीक क्षण जिस पर सिग्नल बेसलाइन पर लौटता है, उसका आकलन करना मुश्किल है, विश्राम समय का वर्णन करने के लिए पीक (समय से बेसलाइन 80%) तक बेसलाइन पर वापसी के 80% तक पहुंचने में लगने वाले समय का उपयोग किया गया था।

कुल मिलाकर सिकुड़न माप में आराम करने वाली बीटिंग आवृत्तियों, 20% पीक से पीक संकुचन (टीपी) तक का समय शामिल था। कॉन), और पीक संकुचन से बेसलाइन (टीबी) के 80% तक का समय। कॉन80) (चित्रा 1 बी)। एक तनाव के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, कोशिकाओं को आइसोप्रेनालाईन (आईएसओ) के साथ इनक्यूबेट किया गया था। इसके अलावा, संयोगवश संविदात्मकता माप के साथ, सीए 2+ क्षणिकों को250 हर्ट्ज की नमूना आवृत्ति पर फ्यूरा -2-एसिटोक्सीमिथाइल एस्टर (फुरा -2 एएम) के साथ कोशिकाओं को लोड करके मापा गया था। सीए 2 + माप डेटा को सीए2 + क्षणिक (TP.Ca) में 20% शिखर से शिखर तक के समय और बेसलाइन (TB.Ca 80) के शिखर से80% तक के समय के रूप में दर्शाया गया है (चित्रा 1 सी)। प्रत्येक क्षेत्र के लिए औसत सिकुड़ा हुआ और कैल्शियम गतिज पैरामीटर प्राप्त करने के लिए एक तेज, स्वचालित डेटा विश्लेषण उपकरण का उपयोग किया गया था।

Protocol

1. सेल कल्चर मीडिया और अभिकर्मकों की तैयारी

  1. RPMI1640 के 49 एमएल में बी 27 पूरक (50 x) के 1 एमएल जोड़कर HIPSC-CM मीडिया तैयार करें।
  2. पहले 45 एमएल हाईपीएससी-सीएम मीडिया में नॉकआउट सीरम प्रतिस्थापन के 5 एमएल जोड़कर रीप्लेटिंग माध्यम तैयार करें। फिर, वाई -27632 रॉक अवरोधक (1: 2,000 कमजोर पड़ने; स्टॉक एकाग्रता: 10 एमएम) के 22.5 μL जोड़ें और अच्छी तरह मिलाएं।
  3. नीचे वर्णित के रूप में तहखाने झिल्ली-लेपित प्लेटें तैयार करें:
    1. तहखाने की झिल्ली की एक शीशी को रात भर फ्रिज में या बर्फ के बक्से पर पिघलाएं।
    2. डलबेकको के संशोधित ईगल के माध्यम / हैम के एफ 12 (डीएमईएम / एफ 12) की उचित मात्रा के साथ तहखाने की झिल्ली को पतला करें। चूंकि तहखाने की झिल्ली के प्रत्येक बैच में एक अलग एकाग्रता होती है, इसलिए 1 मिलीग्राम / 1 एमएल कमजोर पड़ने तक पहुंचने के लिए आवश्यक डीएमईएम / एफ 12 की मात्रा की गणना करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए 0.5 या 1 एमएल एलिकोट बनाएं।
      नोट: चरण 1.3.2 को प्रवाह हुड के अंदर बर्फ पर किया जाना चाहिए।
    3. तहखाने की झिल्ली के 0.5 मिलीलीटर एलिकोट को पिघलाएं और इसे डीएमईएम / एफ 12 के 6 एमएल के साथ पतला करें। अच्छी तरह मिलाएं।
    4. 24-वेल प्लेट में 250 μL पतला तहखाने की झिल्ली/ कुएं को पाइप करके प्लेट को कोट करें। विभिन्न प्लेट प्रारूपों के लिए प्रत्येक कुएं के सतह क्षेत्र के आधार पर गणना करें, उदाहरण के लिए, 6-वेल प्लेट में 1 एमएल /
    5. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 1 घंटे के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  4. 1 एमएम एलिकोट तैयार करने के लिए निर्माता के मैनुअल के अनुसार, डिमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) में फुरा -2 एएम को घोलकर फ्यूरा -2 एएम एलिकोट तैयार करें। एलिकोट को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. एचआईपीएससी-सीएम का संवर्धन

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में HIPSC-CM की एक शीशी को पिघलाएं। शीशी की पिघली हुई सामग्री को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। कोशिकाओं में ड्रॉपवाइज तरीके से रीप्लेटिंग माध्यम के 10 एमएल जोड़ें।
  2. 100 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
  3. सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और 1 एमएल रीप्लेटिंग माध्यम जोड़ें। गोली को फिर से निलंबित करने और किसी भी सेल क्लंप को हटाने के लिए धीरे से ऊपर और नीचे पाइप करें।
  4. कोशिकाओं की संख्या गिनने के लिए हेमोसाइटोमीटर या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करें।
  5. इनक्यूबेट प्लेट से बेसमेंट झिल्ली को हटा दें और इसे रीप्लेटिंग माध्यम से बदलें।
  6. 6/12/24/48/96-वेल प्लेट पर एक उपयुक्त सेल घनत्व के साथ कोशिकाओं को प्लेट करें जो बेसमेंट झिल्ली के साथ लेपित है (उदाहरण के लिए, 24-वेल प्लेट में 250,000 कोशिकाएं /
    नोट: सीए2+ क्षणिक प्रयोगों के लिए, ग्लास-बॉटम प्लेटों पर कोशिकाओं को प्लेट करें।
  7. अगले दिन माध्यम को HIPSC-CM कल्चर माध्यम से बदलें और बाद में 24-वेल प्लेट में 0.5 एमएल / वेल का उपयोग करके हर दूसरे दिन माध्यम को ताज़ा करें।
  8. एक बार जब एचआईपीएस-सीएम पिघलने और रीप्लेटिंग से ठीक हो जाते हैं (इस प्रोटोकॉल में रीप्लेटिंग के 3-5 दिन बाद)।
    नोट: असमान सेल रीप्लेटिंग के मामले में, यह संभव है कि कोशिकाओं का एक समूह बाकी रीप्लेटेड कोशिकाओं के संपर्क में नहीं है और कुछ अनियमित या गैर-सिंक्रनाइज़ बीटिंग पैटर्न दिखा सकता है। सिंक्रनाइज़ से बचने के लिए, यह सलाह दी जाती है कि कोशिकाओं का समान वितरण और प्रत्येक कुएं में एचआईपीएस-सीएम का एक सिंक्रनाइज़ अच्छी तरह से जुड़ा मोनोलेयर हो।

3. अनुबंध माप

  1. प्रकाशिकी-आधारित माप प्रणाली, माइक्रोस्कोप प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) प्रकाश स्रोत, और कंप्यूटर पर स्विच करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. प्रोग्राम खोलें और एक नई फ़ाइल खोलें। स्क्रीन के ऊपरी बाईं ओर फ़ाइल के अंतर्गत, नया क्लिक करें.
  3. एकत्रित पर क्लिक करें, प्रयोग चुनें, और फिर "आईपीएससी + कैल्शियम" चुनें।
  4. जलवायु नियंत्रण डिवाइस चालू करें। तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस और सीओ2 स्तर को 5% पर सेट करें।
  5. हाईपीएससी-सीएम कल्चर माध्यम को टाइरोड समाधान (24-वेल प्लेट में 0.5 एमएल / वेल) से बदलें। प्लेट ढक्कन को जलवायु नियंत्रण ढक्कन के साथ बदलें।
    नोट: यदि कैल्शियम क्षणिक माप करने की आवश्यकता है, तो कोशिकाओं को फुरा -2 एएम के साथ लोड करें, जैसा कि अनुभाग 4 में वर्णित है।
  6. प्लेट को प्रकाशिकी-आधारित माप प्रणाली के अंदर रखें जब जलवायु नियंत्रण उपकरण दिखाता है कि तापमान 37 डिग्री सेल्सियस है।
    नोट: संकुचन उज्ज्वल क्षेत्र स्थितियों का उपयोग करके मापा जाता है।
  7. टूलबार के नीचे ओपन सेल फाइंडर पर क्लिक करें और एक नई स्क्रीन पॉप अप होने की प्रतीक्षा करें। स्क्रीन के शीर्ष दाईं ओर, प्लेट प्रारूप और कुएं का चयन करें।
  8. एक अच्छी तरह से चुनें, सिंक्रनाइज़ संकुचन और विश्राम का निरीक्षण करने के लिए कुएं के भीतर एक क्षेत्र चुनें, शुरुआत दबाएं, माप जोड़ें पर क्लिक करें। सेटिंग्स में माप की अवधि (10 एस प्रति क्षेत्र) का चयन करें। सिंक्रनाइज़ संकुचन माप को तुरंत छोड़ दें और एक नया क्षेत्र चुनें।
    नोट: मॉनिटर पर वास्तविक समय अनुबंध क्षणिक देखा जा सकता है। सिंक्रनाइज़ संकुचन के लिए, एक चिकनी निरंतर क्षणिक देखा जाता है, जबकि सिंक्रनाइज़ किए गए संकुचन के लिए, छोटे अतिरिक्त शिखर देखे जाते हैं।
  9. कुएं के आकार के आधार पर कुएं के भीतर कई क्षेत्रों को मापें। उदाहरण के लिए, इस अध्ययन का पालन करने के लिए, 24-वेल प्लेट में प्रति कुएं 10 क्षेत्रों को मापें। यदि केवल आधारभूत माप की आवश्यकता है और किसी भी यौगिक का परीक्षण करने की कोई योजना नहीं है, तो चरण 3.13 से जारी रखें।
  10. एक कुएं के भीतर के क्षेत्रों को मापने के बाद, कुएं में स्ट्रेसर / यौगिक जोड़ने के लिए प्रकाशिकी-आधारित माप उपकरण को पूरा दबाएं और खोलें (उदाहरण के लिए, 500 एनएम आईएसओ, टाइरोड में घुल गया)।
  11. ब्याज के चक्रवृद्धि के आधार पर इनक्यूबेशन समय चुनें (इस प्रोटोकॉल में आईएसओ के साथ 2 मिनट)।
  12. प्रकाशिकी-आधारित माप उपकरण को उन्हीं क्षेत्रों में माप करने की अनुमति देने के लिए स्वचालित माप पर क्लिक करें जहां बेसलाइन माप किए गए थे, जिसके परिणामस्वरूप कुएं के भीतर युग्मित माप होते हैं।
  13. कुएं में सभी माप ों के पूरा हो जाने के बाद पूरा दबाएं।
  14. स्क्रीन के शीर्ष दाईं ओर से अगला कुआं चुनें।
  15. सभी आवश्यक कुओं के लिए माप जारी रखें।
  16. सभी आवश्यक कुओं को मापने के बाद रोकें पर क्लिक करें और फ़ाइल सहेजें।
    नोट: स्थिर सीओ2 को बनाए रखने के लिए जलवायु नियंत्रण का उपयोग किया जाता है। यह हाई-स्पीड तरीके से HIPSC-CM पर यौगिकों / तनावों के प्रभाव को मापने की अनुमति देता है।

4. कैल्शियम क्षणिक माप

  1. 37 डिग्री सेल्सियस टाइरोड घोल तैयार करें।
  2. टायरोड समाधान में फुरा -2 एएम एलिकोट को घोलें ताकि कोशिकाओं में 1 μM Fura-2 AM की अंतिम एकाग्रता जोड़ी जाएगी।
    नोट: फुरा -2 एएम का उपयोग करते समय, सुनिश्चित करें कि प्रकाश जोखिम को कम करने के लिए प्रवाह हुड में रोशनी बंद है।
  3. माध्यम को एस्पिरेट करें और इसे फ्यूरा -2 एएम युक्त टाइरोड समाधान के साथ बदलें।
  4. इनक्यूबेटर में या प्रकाशिकी-आधारित माप प्रणाली में 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. फुरा -2 एएम युक्त टायरोड समाधान को हटा दें, और बाद में ताजा टाइरोड समाधान के साथ 2 x धो लें। अंत में, फ्यूरा -2 एएम के डी-एस्टरीफिकेशन की अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक और 5 मिनट के लिए टायरोड समाधान में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  6. प्लेट को प्रकाशिकी-आधारित माप प्रणाली के अंदर रखें और माप शुरू करें, जैसा कि अनुभाग 3 में वर्णित है।
    नोट: चरण 4.6 में। संकुचन माप के साथ माप शुरू करके, एक अनुपातमीट्रिक कैल्शियम क्षणिक दर्ज किया जाता है: 100 μm स्पॉट में 340 nm और 385 nm पर उत्तेजना; उत्सर्जन 510 ± 40 एनएम पर एकत्र किया गया। अनुबंध के निशान के अलावा, स्क्रीन पर वास्तविक समय अनुपातमीट्रिक कैल्शियम क्षणिक दिखाई देंगे।

5. डेटा विश्लेषण

  1. डेटा का विश्लेषण करने के लिए, डेस्कटॉप पर CytoSolver क्लिक करें।
  2. आयात पर क्लिक करें और विश्लेषण की जाने वाली फ़ाइल का चयन करें।
  3. कार्यक्रम द्वारा विश्लेषण करने के बाद, स्क्रीन पर दिखाई देने वाले स्वीकृत (नीले) और अस्वीकृत (लाल) क्षणिकों का निरीक्षण करें (चित्रा 1 ए)।
    नोट: यहां, सिग्नल टू शोर अनुपात (एसएनआर) और फिट (आर 2) की अच्छाई द्वारा परिभाषित निम्नलिखित डिफ़ॉल्ट अस्वीकृति मानदंड ों का उपयोग किया गया था: संकुचन क्षणिक के लिए आर 2 > 0.9 और एसएनआर > 4, और कैल्शियम क्षणिकों के लिए आर2 > 0.5 और एसएनआर > 3। इन अस्वीकृति मानदंडों को माप की गुणवत्ता, कोशिकाओं की गुणवत्ता और शोधकर्ता के लिए प्राथमिक परिणाम के आधार पर उपयोगकर्ता द्वारा समायोजित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यदि शोधकर्ता की रुचि मुख्य रूप से विश्राम कैनेटीक्स है, तो चरम चर के समय के लिए मानदंड कम किया जा सकता है। यदि बहुत मजबूत कैल्शियम क्षणिक प्राप्त किए जाते हैं, तो शोर वाले डेटा को बाहर करने के लिए एसएनआर को बढ़ाना पड़ सकता है।
  4. निर्यात पर क्लिक करें और औसत क्षणिक डेटा के लिए टिक करें। स्प्रेडशीट में प्रस्तुत विश्लेषण किए गए डेटा का निरीक्षण करें।
  5. कंप्यूटर और अन्य सभी उपकरणों को बंद कर दें।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, संविदात्मकता, सीए2 + क्षणिक, और एचआईपीएस-सीएम में एक यौगिक की प्रतिक्रिया के माप किए गए थे। इस प्रकाशिकी-आधारित माप प्रणाली का उपयोग करके, HIPSC-CM को केवल आवश्यक प्लेटों पर फिर से चढ़ाया जा सकता है, और अनुबंध माप किया जा सकता है। एक संदर्भ फ्रेम के सापेक्ष पिक्सेल सहसंबंध की गणना करके 250 फ्रेम प्रति सेकंड पर 100 μm x 100 μm क्षेत्र (ROI) में संविदात्मकता को मापा जाता है। संदर्भ फ्रेम स्वचालित रूप से सिस्टम द्वारा अंत-डायस्टोलिक पर पता लगाया जाता है। संकुचन माप के साथ ही, एक अनुपातमीट्रिक कैल्शियम क्षणिक दर्ज किया जाता है।

इस अध्ययन में, भेदभाव के तीन अलग-अलग दौर का उपयोग तीन जैविक प्रतिकृतियों के रूप में किया गया था। भेदभाव के प्रत्येक बैच के लिए, तीन कुओं को तकनीकी प्रतिकृति के रूप में मापा गया था। यह अध्ययन 24-वेल प्लेटों का उपयोग करके किया गया था, और प्रत्येक कुएं के भीतर 10 क्षेत्रों को मापा गया था। माप के बाद, साइटोसॉल्वर प्रोग्राम का उपयोग तुरंत डेटा का विश्लेषण करने के लिए किया गया था। निम्नलिखित मापदंडों की सूचना दी गई थी: आराम करने वाली धड़कन आवृत्ति, टीपी। कॉन, और टीबी। नियंत्रण HIPSC-CMs का80 (चित्रा 2A-C)। प्रत्येक उल्लिखित पैरामीटर के लिए डेटा की परिवर्तनशीलता की कल्पना करने के लिए, प्रत्येक कुएं के भीतर माप और भेदभाव के प्रत्येक दौर के लिए तीन कुओं के औसत मूल्यों को सुपरप्लॉट10 के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। विभेदन के प्रत्येक दौर और तीन दौरों के बीच डेटा की परिवर्तनशीलता का बेहतर मूल्यांकन करने के लिए, प्रत्येक पैरामीटर के लिए विचरण गुणांक (चित्रा 2 डी) की गणना की गई थी। जैसा कि चित्र 2 डी में दिखाया गया है, एक जैविक प्रतिकृति के अनुरूप तकनीकी प्रतिकृति के मान एक दूसरे के बहुत करीब सीमा के भीतर आते हैं (यानी, विचरण का कम गुणांक), जो इस विधि की मजबूती को दर्शाता है।

यह आवेदन दवा प्रभाव का परीक्षण करने के लिए बहुत अच्छी तरह से अनुकूल है। यहां, नियंत्रण एचआईपीएस-सीएम की अनुबंध पर एक गैर-चयनात्मक β-एड्रीनर्जिक रिसेप्टर एगोनिस्ट 500 एनएम आईएसओ के प्रभाव का परीक्षण किया गया था। यह यौगिक हृदय गति को बढ़ाने और सकारात्मक लुसिट्रोपिक प्रभाव डालने के लिए जाना जाता है। जैसा कि चित्र 3 ए में दर्शाया गया है, आईएसओ ने सभी कुओं में धड़कन आवृत्ति में काफी वृद्धि की है। आईएसओ ने कैनेटीक्स में भी वृद्धि की, जो टीपी में कमी में स्पष्ट है। कॉन और टीबी। कॉन80 (चित्रा 3 बी, सी)। कुल मिलाकर, आईएसओ के साथ इनक्यूबेशन पर, संकुचन और विश्राम समय में कमी के साथ-साथ सभी कुओं में धड़कन आवृत्ति में काफी वृद्धि हुई थी, जिसने संकेत दिया कि इस परिसर के लिए अपेक्षित प्रतिक्रिया इस मंच द्वारा पंजीकृत की गई थी।

अनुबंध माप के समानांतर, कैल्शियम माप भी किए गए थे। अनुबंध डेटा (चित्रा 2) के समान फैशन में, एचआईपीएस-सीएम के कैल्शियम माप डेटा को चित्रा 4 में दर्शाया गया है। TB.Ca80 पृथक चूहे या माउस कार्डियोमायोसाइट्स की तुलना में काफी धीमा है, जिसे आंशिक रूप से प्रजातियों और हृदय गति के अंतर11 द्वारा समझाया गया है, साथ ही साथ सारकोप्लाज्मिक रेटिकुलम के भीतर कम कैल्शियम गतिशीलता औरप्राथमिक कोशिकाओं की तुलना में कैल्शियम हैंडलिंग प्रोटीन की कम अभिव्यक्ति के कारण एचआईपीएस-सीएम में अपरिपक्व कैल्शियम हैंडलिंग द्वारा।. अनुबंध डेटा के समान, कैल्शियम माप के लिए विचरण के गुणांक की गणना की गई थी, और तकनीकी और जैविक प्रतिकृति (चित्रा 4 सी) के भीतर कम परिवर्तनशीलता दिखाती है।

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चित्रा 1: डेटा का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग के बाद साइटोसॉल्वर क्षणिक विश्लेषण उपकरण का तत्काल उपयोग। (ए) एक कुएं के भीतर मापा गया एक क्षेत्र के स्वीकृत क्षणिकता (सभी नीले रंग में) का एक उदाहरण। पैनल ए 1 सिकुड़ा हुआ क्षणिकता को दर्शाता है। पैनल ए 2 कैल्शियम क्षणिकता का प्रतिनिधित्व करता है। (बी) विभेदन के एक दौर के तीन कुओं में माप से प्राप्त औसत संकुचन क्षणिक। प्रत्येक एकल या औसत क्षणिक से, समय के विभिन्न समय बिंदुओं से लेकर शिखर (टीपी) तक डेटा। कॉन) और बेसलाइन (टीबी) का समय। अनुबंध क्षणिक का संयोजन निकाला जा सकता है। चूंकि संकुचन की सटीक शुरुआत हमेशा स्पष्ट रूप से निर्धारित नहीं की जा सकती है, इसलिए चरम पर 20% तक का समय समय के माप के लिए शुरुआती बिंदु के रूप में लिया जाता है। इसी तरह, सटीक क्षण जिस पर सिग्नल बेसलाइन पर लौटता है, उसका आकलन करना मुश्किल है। इसलिए, विश्राम के समय का वर्णन करने के लिए बेसलाइन 80% के समय का उपयोग किया जाता है। यहाँ, टीपी। कॉन (पीक का समय - समय से चरम 20%) और टीबी। कॉन80 (बेसलाइन का समय 80% - समय से पीक) का उपयोग किया जाता है। (सी) विभेदन के एक दौर के तीन कुओं में माप से प्राप्त औसत कैल्शियम क्षणिक डेटा। प्रत्येक एकल या औसत कैल्शियम क्षणिक से, कैल्शियम क्षणिकों के चरम (TP.Ca) और बेसलाइन (TB.Ca) के समय के विभिन्न समय बिंदुओं से डेटा निकाला जा सकता है। समय से चरम माप के लिए, प्रारंभिक बिंदु 20% तक का समय है, और बेसलाइन के समय के लिए, अंतिम बिंदु बेसलाइन 80% तक का समय है। इस अध्ययन में, TP.Ca (समय से शिखर - समय से शिखर 20%) और TB.Ca 80 (समय से बेसलाइन 80% - समय से पीक) का उपयोग किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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चित्रा 2: भेदभाव के तीन अलग-अलग दौरों पर किए गए बेसलाइन अनुबंध माप। भेदभाव के प्रत्येक दौर के लिए तीन जैविक प्रतिकृतियां और तीन कुएं (यानी, तीन तकनीकी प्रतिकृतियां)। भेदभाव के प्रत्येक दौर के लिए तीन मुख्य प्रतीक प्रत्येक कुएं के भीतर मापा क्षेत्रों (फीके रंगों में पृष्ठभूमि प्रतीक) के औसत मूल्य का प्रतिनिधित्व करते हैं। डेटा को एसईएम ± माध्य के रूप में दिखाया जाता है। आराम करने वाली बीटिंग आवृत्ति के बारे में डेटा हर्ट्ज में दर्शाया जाता है, और टीपी के लिए। कॉन और टीबी। 80 पर, डेटा सेकंड में हैं। (ए) आराम करने वाली धड़कन आवृत्ति। (बी) चरम पर समय (टीपी) कॉन)। (सी) बेसलाइन 80% (टीबी) के लिए समय। कॉन80)। (घ) प्रत्येक दौर में प्राप्त आंकड़ों और विभेदन के तीनों दौरों के बीच भिन्नता का मूल्यांकन करने के लिए, विचरण प्रतिशत गुणांक की गणना प्रत्येक कुएं के औसत मूल्यों का उपयोग करके की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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चित्र 3: भेदभाव के तीन दौर ों से तीन कुओं पर आईएसओ (+) के साथ इनक्यूबेशन के बाद बेसलाइन (-) और बाद में सिकुड़न माप। (ए) 500 एनएम आईएसओ (+) के साथ इनक्यूबेशन के बाद आराम करने वाली धड़कन आवृत्ति (-) और धड़कन आवृत्ति। (बी) चरम पर समय (टीपी) कॉन) बेसलाइन पर और आईएसओ के साथ इनक्यूबेशन के बाद माप। (सी) बेसलाइन 80% (टीबी) के लिए समय। कॉन80) बेसलाइन पर और आईएसओ के साथ इनक्यूबेशन के बाद माप। अनुबंध मापदंडों पर आईएसओ के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, बोनफेरोनी सुधार के साथ एक दो-तरफा एनोवा का प्रदर्शन किया गया था। डेटा को एसईएम ± माध्य के रूप में दिखाया गया है। आराम करने वाली बीटिंग आवृत्ति के बारे में डेटा हर्ट्ज और टीपी में दर्शाया गया है। कॉन और टीबी। 80 पर, डेटा को सेकंड में दर्शाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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चित्रा 4: भेदभाव के तीन दौर से तीन कुओं पर किए गए बेसलाइन कैल्शियम क्षणिक माप। (ए) कैल्शियम क्षणिकों के 80% (TB.Ca80) को चरम पर पहुंचने का समय (TP.Ca) और (बी) समय। डेटा को SEM ± माध्य के रूप में दिखाया जाता है। TP.Ca औरTB.Ca 80 डेटा सेकंड में दर्शाए जाते हैं। (ग) प्रत्येक दौर में प्राप्त आंकड़ों और विभेदन के सभी तीन दौरों के बीच भिन्नता का मूल्यांकन करने के लिए, विचरण प्रतिशत के गुणांक की गणना प्रत्येक कुएं के औसत मूल्य का उपयोग करके की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

इस अध्ययन में, एचआईपीएस-सीएम पर सिकुड़न और कैल्शियम क्षणिक माप करने और इन कोशिकाओं पर तनाव / दवाओं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है। अनुबंध माप, अनुपातमीट्रिक कैल्शियम माप, और आईएसओ की प्रतिक्रिया जैविक प्रतिकृति के रूप में भेदभाव के तीन अलग-अलग दौर पर की गई थी। प्रत्येक जैविक प्रतिकृति के लिए, तकनीकी प्रतिकृति के रूप में तीन कुओं पर माप किए गए थे। इस तरह से माप करने का कारण यह सुनिश्चित करना था कि जैविक परिवर्तनशीलता और नमूना और मंच की तकनीकी परिवर्तनशीलता का मूल्यांकन किया जा सके। जैविक और तकनीकी प्रतिकृतियों की उचित संख्या पर विचार करने के अलावा, HIPSC-CM संवर्धन स्थिति निरंतर और मजबूत परिणाम प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकती है। मानदंडों के अनुरूप होना महत्वपूर्ण है, जैसे कि एचआईपीएस-सीएम की उम्र, माध्यम की संरचना, रीप्लेटिंग की स्थिति और माप के दौरान यौगिक इनक्यूबेशन समय। इस अध्ययन में, एक कुएं में 10 सेकंड के लिए दो बार 11 क्षेत्रों को मापने के लिए औसतन 568 ± 24 सेकंड का समय लगा। इसमें 79 ± 11 सेकंड का आईएसओ इनक्यूबेशन समय शामिल है। यह लगभग 10 मिनट प्रति कुएं तक आता है, जो शोधकर्ताओं को ~ 4 घंटे में एक पूर्ण 24-वेल प्लेट को मापने में सक्षम होना चाहिए। जलवायु नियंत्रण का उपयोग स्थिर सीओ2 को बनाए रखने के लिए किया जाता है। यह हाई-स्पीड तरीके से HIPSC-CM पर यौगिकों / तनावों के प्रभाव को मापने की अनुमति देता है।

आईपीएससी-सीएम के सिकुड़ा हुआ कार्य को मापने के लिए, ऑप्टोजेनेटिक्स13 या लेबल-मुक्त वीडियो-आधारित माइक्रोस्कोपी 5,6 पर निर्भर कई मौजूदा प्रणालियां हैं। ऑप्टोजेनेटिक्स सिस्टम काफी जटिल हैं और इलेक्ट्रोफिज़िकल और / या कॉन्ट्रैक्टिलिटी डेटा प्राप्त करने के लिए विशेष तकनीकों की आवश्यकता होती है। अन्य सिस्टम वीडियो के पोस्ट-हॉक विश्लेषण पर भरोसा करते हैं, जिसके लिए बहुत अधिक भंडारण की आवश्यकता होती है और वीडियो अधिग्रहण के दौरान प्रत्यक्ष प्रतिक्रिया का अभाव होता है। इसके अलावा, पर्याप्त अस्थायी और स्थानिक संकल्प प्राप्त करना कठिन है, जिसके परिणामस्वरूप अंडरसैंपलिंग हो सकती है। इसी तरह, सीआरआईएसपीआर / सीएएस -9-संपादित एचआईपीएस-सीएम फ्लोरोसेंट रिपोर्टर7 के साथ कार्डियोमायोसाइट्स व्यवहार पर अवांछित प्रभाव पेश कर सकते हैं। संकुचन-विश्राम माप के लिए फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग एक सुरुचिपूर्ण दृष्टिकोण भी है, लेकिनलंबी अवधि में एक ही नमूने पर प्रयोग करने को सीमित करता है।

हालांकि, इस प्रकाशिकी-आधारित माप मंच का उपयोग किसी भी फ्लोरोसेंट डाई या आक्रामक तरीकों का उपयोग किए बिना संकुचन-विश्राम समय को मापने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, चूंकि पिक्सेल सहसंबंध स्थानिक जानकारी प्रदान नहीं करता है, इसलिए इस विधि का उपयोग संकुचन की ताकत को मापने के लिए नहीं किया जा सकता है, बल्कि केवल संकुचन और विश्राम की गति में परिवर्तन का विश्वसनीय रूप से पता लगा सकता है। पेश की गई माप प्रणाली तापमान-नियंत्रित है और प्रति सेकंड >200 फ्रेम के रिज़ॉल्यूशन पर वास्तविक समय में कैल्शियम और अनुबंध डेटा प्राप्त कर सकती है। इसके अतिरिक्त, प्रत्येक माप का स्थान संग्रहीत किया जाता है, जो युग्मित माप को सक्षम करता है, जिससे प्रयोगों की शक्ति बढ़ जाती है। इसके अलावा, यह मंच शोधकर्ताओं को डेटा स्टोर करने और प्रयोग के तुरंत बाद उनका विश्लेषण करने की क्षमता प्रदान करता है। कुल मिलाकर, यह प्रकाशिकी-आधारित माप प्रणाली सेलुलर पैथोमैकेनिज्म का अध्ययन करने के लिए एक आशाजनक तरीका दिखाती है, एचआईपीएस-सीएम की कार्यक्षमता पर यौगिकों के प्रभाव का मूल्यांकन कर सकती है, और दवा स्क्रीनिंग में प्रीक्लिनिकल प्रक्रिया के साथ सहायक हो सकती है।

Acknowledgements

इस शोध को यूरोस्टार्स ग्रांट एस्टार्स 2 113937 कार्डियोमायो (ईएम एंड डीके), और एनडब्ल्यूओ-वीआईसीआई ग्रांट 91818602 (जेवी) द्वारा वित्त पोषित किया गया है।

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
µ-Plate 24 Well Black ID 14 mmibidi82421
B-27 Supplement (50x)Thermo Fisher17504044
CytoSolver transient analysis toolCytoCypherA fast automatic data analysis tool
DMEM/F-12Thermo Fisher11320033
Fura-2, AMThermo FisherF1221
Isoprenaline hydrochlorideMerck15627
KnockOut™ Serum ReplacementThermo Fisher10828010
MatrigelMerckCLS3542CBasement membrane
MultiCell CytoCypher with Nikon 20x Super Fluor objective and 730 nm LED light source and Ionwizard softwareCytoCypherOptics-based measurement system
ROCK inhibitor Y-27632Tocris1254
RPMI 1640Thermo Fisher11875119
TyrodeSelf-made solution with final concentration of the following components: NaCl 134 mM, KCl 5 mM, Hepes 12 mM, MgSO4 1.2 mM, NaH2PO4 H2O 1.2 mM, Glucose 11 mM, Sodium Pyrovate 5 mM, 1 mM CaCl2

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