Sanntidsmålinger av kalsium- og kontraktilitetsparametere i humane induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter

Summary

Her beskrives en etablert metode for å utføre kontraktilitets- og kalsiummålinger i humane induserte pluripotente stamcellederiverte kardiomyocytter ved bruk av en optikkbasert plattform. Denne plattformen gjør det mulig for forskere å studere effekten av mutasjoner og responsen på ulike stimuli på en rask og reproduserbar måte.

Abstract

Humane induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs) representerer et kraftig verktøy for å studere mutasjonsmedierte endringer i kardiomyocyttfunksjonen og definere effekten av stressorer og legemiddelintervensjoner. I denne studien er det demonstrert at dette optikkbaserte systemet er et kraftig verktøy for å vurdere funksjonelle parametere for hiPSC-CM i 2D. Ved å bruke denne plattformen er det mulig å utføre parede målinger i et godt bevart temperaturmiljø på forskjellige plateoppsett. Videre gir dette systemet forskere øyeblikkelig dataanalyse.

Denne artikkelen beskriver en metode for å måle kontraktiliteten til umodifiserte hiPSC-CMer. Kontraksjonskinetikk måles ved 37 °C basert på pikselkorrelasjonsendringer i forhold til et referansebilde tatt ved relaksasjon ved en samplingsfrekvens på 250 Hz. I tillegg kan samtidige målinger av intracellulære kalsiumtransienter oppnås ved å laste cellen med en kalsiumfølsom fluorofor, slik som Fura-2. Ved hjelp av en hyperbryter kan ratiometriske kalsiummålinger utføres på et 50 μm diameter belysningspunkt, tilsvarende området for kontraktilitetsmålingene.

Introduction

Hjertesvikt er den ledende dødsårsaken over hele verden. I 2019 forårsaket hjerte- og karsykdommer 18,6 millioner dødsfall globalt, noe som gjenspeiler en økning på 17,1% det siste tiåret¹. Til tross for forskernes innsats for å identifisere legemiddelmål for å forebygge og kurere hjertesvikt, er pasientresultatene fortsatt dårlige². Forskjellen i patofysiologien til dyremodeller med hensyn til mennesker kan være en av de underliggende faktorene i den begrensede suksessen for optimalisering av hjertesviktbehandling³. Ytterligere menneskelignende modeller er berettiget til å modellere sykdom og teste toksisiteten og effektiviteten av nye legemiddelforbindelser.

Humane induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs) representerer et kraftig verktøy for å definere cellulære patomekanismer indusert av stressorer, iskemi, endret metabolisme eller patogene genvarianter, og effektiviteten og toksisiteten av legemiddelintervensjoner⁴. For å definere effekter på de funksjonelle egenskapene til hiPSC-CM, er et høyhastighetssystem som måler de systoliske og diastoliske egenskapene til cellulære sammentrekninger på en objektiv og reproduserbar måte, berettiget. Dette overordnede målet med den nåværende studien er å demonstrere at et optikkbasert system er et kraftig verktøy for å utføre sanntidsanalyser av de funksjonelle parametrene til hiPSC-CMs.

For tiden er det flere plattformer for å evaluere kontraktiliteten til hiPSC-CMs. Imidlertid tilbyr nåværende systemer enten en langsom avlesning, eller det nødvendige antall celler kan være en utfordring. Etikettfrie videomålingssystemer^5,6 er avhengige av post-hoc-analyse av videoer^, noe som krever mye lagringsplass og mangler direkte tilbakemelding under videoopptak. I tillegg er tilstrekkelig tidsmessig og romlig oppløsning vanskelig å oppnå, og kan føre til undersampling. Andre metoder for å bestemme kardiomyocytegenskaper, for eksempel grupperte regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner (CRISPR) / Cas9-redigerte hiPSC-CMs⁷ med fluorescerende reportere, kan forstyrre genstabiliteten til cellene og kreve spesialisert laboratoriekompetanse.

For å overvinne begrensningene nevnt ovenfor, ble et unikt optikkbasert målesystem utviklet og introdusert i denne studien. Denne plattformen muliggjør kontraktilitetsmålinger på umodifiserte hiPSC-CM-er ved ganske enkelt å replatere dem på et hvilket som helst nødvendig plateformat, uten noen begrensning i platestørrelse. Videre tillater sanntidsmålinger direkte observasjon og analyser av de funksjonelle parametrene til hiPSC-CM, og gir dermed en eksperimentell innstilling for å umiddelbart justere og optimalisere protokoller. Videre lagres plasseringen av hver måling, noe som muliggjør parrede målinger på samme prøve, og dermed øker kraften i forsøkene.

For å demonstrere det optikkbaserte systemet ble kontraktilitetsmålinger utført på en kontrollhiPSC-CM-linje. Denne kontrollhisc-linjen ble generert fra dermal fibroblast av en sunn mannlig donor med en normal karyotype⁸. Kontraksjonskinetikk ble målt ved 37 °C, basert på pikselkorrelasjonsendringer i forhold til et referansebilde tatt under relaksasjon med 250 Hz samplingsfrekvens. Siden den nøyaktige starten på sammentrekningen ikke alltid kan bestemmes entydig, ble tidspunktet da 20% av topphøyden ble nådd (tid til topp 20%) tatt som utgangspunkt for målinger av tid til topp. Ved å gjøre dette ble det funnet mindre variabilitet for denne parameteren i en prøve. På samme måte, ettersom det nøyaktige tidspunktet signalet returnerer til baseline er vanskelig å vurdere, ble tiden det tok å nå 80 % av returen til baseline fra topp (tid til baseline 80 %) brukt til å beskrive relaksasjonstiden.

Samlede kontraktilitetsmålinger inkluderte hvilende slagfrekvenser, tiden fra 20% peak til peak contraction (TP. Con), og tiden fra maksimal sammentrekning til 80 % av baseline (TB. Con₈₀) (figur 1B). For å teste effekten av en stressor ble cellene inkubert med isoprenaline (ISO). I tillegg, sammenfallende med kontraktilitetsmålinger, ble Ca 2+ transienter målt ved å laste cellene med Fura-2-acetoksymetylester (Fura-2 AM) med en samplingsfrekvens på 250 Hz. Ratiometriske Ca²⁺ målinger⁹ ved hjelp av en hyperbryter ble gjort på et 50 μm diameter belysningsområde, tilsvarende arealet av kontraktilitetsmålingene. Ca 2+ måledata er vist som tid fra 20 % topp til topp i Ca²⁺ forbigående (TP.Ca) og tid fra topp til 80 % av basislinjen (TB.Ca₈₀) (figur 1C). Et raskt, automatisk dataanalyseverktøy ble brukt for å gi gjennomsnittlige kontraktile og kalsiumkinetiske parametere for hvert område.

Protocol

1. Fremstilling av cellekulturmedier og reagenser

1. Forbered hiPSC-CM-medier ved å tilsette 1 ml B27-tilskudd (50x) til 49 ml RPMI1640.
2. Forbered replatingmediet ved først å tilsette 5 ml knockout serumerstatning til 45 ml hiPSC-CM-medier. Deretter tilsettes 22,5 μL Y-27632 ROCK-hemmer (1:2000 fortynning; stamkonsentrasjon: 10 mM) og blandes godt.
3. Forbered kjellermembranbelagte plater som beskrevet nedenfor:
   1. Tine et hetteglass med kjellermembran over natten i kjøleskapet eller på en isboks.
   2. Fortynn kjellermembranen med en passende mengde Dulbeccos modifiserte Eagle's medium/Ham's F12 (DMEM/F12). Siden hver batch av kjellermembran har en annen konsentrasjon, beregner du mengden DMEM / F12 som trengs for å nå en 1 mg / 1 ml fortynning. Lag 0,5 eller 1 ml alikoter til oppbevaring ved -20 °C.
      MERK: Trinn 1.3.2 må gjøres på is inne i en flythette.
   3. Tine 0,5 ml alikot av kjellermembran og fortynn den med 6 ml DMEM / F12. Bland godt.
   4. Belegg platen med pipettering av 250 μL fortynnet kjellermembran/brønn i en 24-brønnsplate. Beregn basert på overflaten av hver brønn for forskjellige plateformater, for eksempel 1 ml / brønn i en 6-brønns plate.
   5. Inkuber platen i 1 time i en 37 °C inkubator.
4. Forbered Fura-2 AM-alikoter ved å oppløse Fura-2 AM i dimetylsulfoksid (DMSO), i henhold til produsentens håndbok for å forberede 1 mM alikoter. Oppbevar alikotene ved -20 °C.

2. Dyrking av hiPSC-CMs

1. Tine et hetteglass med hisc-CM i et vannbad på 37 °C. Overfør det tinte innholdet i hetteglasset til et 15 ml rør. Tilsett 10 ml av replateringsmediet på en dråpevis måte til cellene.
2. Sentrifuge cellene i 5 minutter ved 100 × g.
3. Fjern supernatanten og tilsett 1 ml replateringsmedium. Piper forsiktig opp og ned for å resuspendere pelleten og fjerne eventuelle celleklumper.
4. Bruk et hemocytometer eller en automatisert celleteller for å telle antall celler.
5. Fjern kjellermembranen fra den inkuberte platen og erstatt den med replatingmediet.
6. Plate cellene med en passende celletetthet på en 6/12/24/48/96-brønnplate belagt med kjellermembran (f.eks. 250.000 celler / brønn i en 24-brønnplate).
   MERK: For Ca²⁺ forbigående eksperimenter, plate cellene på glassbunnplater.
7. Bytt ut mediet med hiPSC-CM dyrkningsmedium neste dag og oppdater deretter mediet annenhver dag med 0,5 ml / brønn i en 24-brønnsplate.
8. Utfør kontraktilitetsmålingene når hiPSC-CMene har kommet seg etter tining og replating (3-5 dager etter replating i denne protokollen).
   MERK: Ved ujevn cellereplating er det mulig at en gruppe celler ikke er i kontakt med resten av de replaterte cellene og kan vise noe uregelmessig eller ikke-synkronisert slagmønster. For å unngå asynkroni anbefales det å ha en jevn fordeling av celler og et synkronisert, godt tilkoblet monolag av hiPSC-CM i hver brønn.

3. Kontraktilitetsmålinger

1. Slå på det optikkbaserte målesystemet, lysdioden for mikroskop (LED) og datamaskinen (se Materialfortegnelse).
2. Åpne programmet og åpne en ny fil. Under Fil øverst til venstre på skjermen klikker du Ny.
3. Klikk på Collect, velg Eksperimenter, og velg deretter "iPSC + Calcium".
4. Slå på klimakontrollenheten. Sett temperaturen til 37 °C og CO₂ -nivået til 5 %.
5. Bytt ut dyrkningsmediet hiPSC-CM med Tyrode-løsning (0,5 ml/brønn i en 24-brønnsplate). Sett på platelokket med klimakontrolllokket.
   MERK: Hvis kalsiumforbigående målinger må utføres, last cellene med Fura-2 AM, som beskrevet i avsnitt 4.
6. Plasser platen inne i det optiske målesystemet når klimakontrollenheten viser at temperaturen er 37 °C.
   MERK: Sammentrekning måles ved hjelp av brightfield-forhold.
7. Klikk på Åpne cellesøker under verktøylinjen og vent til en ny skjerm dukker opp. Øverst til høyre på skjermen velger du plateformat og brønn.
8. Velg en brønn, velg et område i brønnen for å observere synkronisert sammentrekning og avslapning, Trykk på start, klikk på Legg til måling. Velg varigheten av målingene i innstillingene (10 s per område). Kast asynkroniserte sammentrekningsmålinger umiddelbart og velg et nytt område.
   MERK: Kontraktilitetstransientene i sanntid kan sees på skjermen. For synkroniserte sammentrekninger observeres en jevn kontinuerlig transient, mens for asynkroniserte sammentrekninger observeres små ekstra topper.
9. Mål flere områder i brønnen avhengig av størrelsen på brønnen. For eksempel, for å følge denne studien, måle 10 områder per brønn i en 24-brønns plate. Hvis det bare er behov for basismålinger og det ikke foreligger noen plan om å teste noen forbindelser, fortsetter du fra trinn 3.13.
10. Etter at områdene i en brønn er målt, trykk komplett og åpne det optikkbaserte måleinstrumentet for å legge til stressoren/forbindelsen til brønnen (f.eks. 500 nM ISO, oppløst i Tyrode).
11. Velg inkubasjonstiden avhengig av forbindelsen av interesse (2 min med ISO i denne protokollen).
12. Klikk på automatisk måling for å la det optikkbaserte måleinstrumentet utføre målinger i de samme områdene der referansemålingene ble utført, noe som resulterer i parvise målinger i brønnen.
13. Trykk på fullført når alle målingene i brønnen er utført.
14. Velg neste brønn øverst til høyre på skjermen.
15. Fortsett målingene for alle nødvendige brønner.
16. Klikk stopp når alle nødvendige brønner er målt og lagre filen.
    MERK: Klimakontrollen brukes til å opprettholde stabil CO₂. Dette gjør det mulig å måle effekten av forbindelser/stressfaktorer på hiPSC-CM på en høyhastighets måte.

4. Kalsium forbigående målinger

1. Tilbered 37 °C Tyrode oppløsning.
2. Løs opp Fura-2 AM-alikotene i Tyrode-løsningen slik at en endelig konsentrasjon på 1 μM Fura-2 AM blir tilsatt cellene.
   MERK: Når du bruker Fura-2 AM, må du kontrollere at lysene i strømningshetten er slått av for å minimere lyseksponering.
3. Aspirer mediet og erstatt det med Tyrode oppløsning inneholdende Fura-2 AM.
4. Inkuber i 15 minutter ved 37 °C i en inkubator eller i det optikkbaserte målesystemet.
5. Fjern Tyrode oppløsningen inneholdende Fura-2 AM, og vask deretter 2x med ny Tyrode oppløsning. Til slutt, inkuber cellene i Tyrode-oppløsningen i ytterligere 5 minutter ved 37 °C for å tillate de-forestring av Fura-2 AM.
6. Plasser platen inne i det optiske målesystemet og start målingene, som beskrevet i avsnitt 3.
   MERK: I trinn 4.6. Ved å starte målingene samtidig med kontraksjonsmålingene, registreres en ratiometrisk kalsiumtransient: eksitasjon ved 340 nm og 385 nm i et 100 μm punkt; Utslipp samlet ved 510 ± 40 nm. I tillegg til kontraktilitetssporene vil sanntidsratiometriske kalsiumtransienter vises på skjermen.

5. Dataanalyse

1. Hvis du vil analysere dataene, klikker du CytoSolver på skrivebordet.
2. Klikk på importer og velg filen (e) som skal analyseres.
3. Etter at programmet har utført analysen, observer de aksepterte (blå) og avviste (røde) transientene som vises på skjermen (figur 1A).
   MERK: Her ble følgende standard avvisningskriterier, definert ved signal/støy-forhold (SNR) og tilpasningsgodhet (R 2), brukt: R 2 > 0,9 og SNR > 4 for kontraksjonstransienter, og R² > 0,5 og SNR > 3 for kalsiumtransienter. Disse avvisningskriteriene kan justeres av brukeren avhengig av kvaliteten på målingene, kvaliteten på cellene og det primære utfallet for forskeren. For eksempel, hvis forskerens interesse hovedsakelig er avslapningskinetikk, kan kriteriene senkes for tiden til toppvariabler. Hvis svært sterke kalsiumtransienter oppnås, kan det hende at SNR må økes for å utelukke data som er mer støyende.
4. Klikk på eksport og merk av for gjennomsnittlige forbigående data. Inspiser de analyserte dataene som presenteres i et regneark.
5. Slå av datamaskinen og alle de andre instrumentene.

Discussion

I denne studien beskrives en metode for å utføre kontraktilitets- og kalsiumtransientmålinger på hiPSC-CM og studere effekten av stressorer/medikamenter på disse cellene. Kontraktilitetsmålinger, ratiometriske kalsiummålinger og respons på ISO ble utført på tre forskjellige runder med differensiering som biologiske replikater. For hver biologisk replikat ble det utført målinger på tre brønner som de tekniske replikatene. Bakgrunnen for å utføre målingene på denne måten var å sikre at den biologiske variabiliteten og den tekniske variasjonen i prøven og plattformen kunne evalueres. Bortsett fra å vurdere riktig antall biologiske og tekniske replikater, kan hiPSC-CM-dyrkingstilstanden spille en viktig rolle for å oppnå konstante og robuste resultater. Det er viktig å være konsistent med kriterier, for eksempel alder av hiPSC-CMs, sammensetning av medium, replating forhold, og sammensatt inkubasjonstid under målinger. I denne studien tok det i gjennomsnitt 568 ± 24 s å måle 11 områder to ganger i 10 s i en brønn. Dette inkluderer en ISO-inkubasjonstid på 79 ± 11 s. Dette kommer ned til omtrent 10 min per brønn, noe som skal gjøre det mulig for forskere å måle en full 24-brønnsplate i ~ 4 timer. Klimakontrollen brukes til å opprettholde stabil CO₂. Dette gjør det mulig å måle effekten av forbindelser/stressfaktorer på hiPSC-CM på en høyhastighets måte.

For å måle kontraktilfunksjonen til iPSC-CMs, er det flere eksisterende systemer som er avhengige av optogenetikk¹³ eller etikettfri videobasert mikroskopi ^5,6. Optogenetikksystemer er ganske komplekse og krever spesielle teknikker for å oppnå enten elektrofysiske og / eller kontraktilitetsdata. Andre systemer er avhengige av post-hoc-analyse av videoer, noe som krever mye lagring og mangler direkte tilbakemelding under videooppkjøp. I tillegg er det vanskelig å oppnå tilstrekkelig tidsmessig og romlig oppløsning, noe som kan føre til undersampling. På samme måte kan CRISPR/CAS-9-redigerte hiPSC-CM med fluorescerende reportere⁷ introdusere uønskede effekter på kardiomyocyttatferd. Bruk av fluorescerende fargestoffer for sammentrekningsavslapningsmålinger er også en elegant tilnærming, men begrenser utførelsen av eksperimenter på samme prøve over en lengre periode¹⁴.

Denne optikkbaserte måleplattformen kan imidlertid brukes til å måle sammentrekningsavslapningstider uten å bruke fluorescerende fargestoff eller invasive metoder. Siden pikselkorrelasjon ikke gir romlig informasjon, kan denne metoden imidlertid ikke brukes til å måle styrken på sammentrekningen, men kan bare pålitelig oppdage endringer i hastigheten på sammentrekning og avslapning. Det introduserte målesystemet er temperaturkontrollert og kan samle kalsium- og kontraktilitetsdata i sanntid med en oppløsning på >200 bilder per sekund. I tillegg lagres plasseringen av hver måling, noe som muliggjør parvise målinger, og dermed øker kraften til eksperimentene. Videre gir denne plattformen forskere muligheten til å lagre data og analysere dem umiddelbart etter eksperimentet. Samlet sett viser dette optikkbaserte målesystemet seg å være en lovende metode for å studere cellulære patomekanismer, kan evaluere effekten av forbindelser på funksjonaliteten til hiPSC-CM, og kan være nyttig med den prekliniske prosessen i legemiddelscreening.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
µ-Plate 24 Well Black ID 14 mm	ibidi	82421
B-27 Supplement (50x)	Thermo Fisher	17504044
CytoSolver transient analysis tool	CytoCypher		A fast automatic data analysis tool
DMEM/F-12	Thermo Fisher	11320033
Fura-2, AM	Thermo Fisher	F1221
Isoprenaline hydrochloride	Merck	15627
KnockOut™ Serum Replacement	Thermo Fisher	10828010
Matrigel	Merck	CLS3542C	Basement membrane
MultiCell CytoCypher with Nikon 20x Super Fluor objective and 730 nm LED light source and Ionwizard software	CytoCypher		Optics-based measurement system
ROCK inhibitor Y-27632	Tocris	1254
RPMI 1640	Thermo Fisher	11875119
Tyrode			Self-made solution with final concentration of the following components: NaCl 134 mM, KCl 5 mM, Hepes 12 mM, MgSO4 1.2 mM, NaH2PO4 H2O 1.2 mM, Glucose 11 mM, Sodium Pyrovate 5 mM, 1 mM CaCl2