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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo a preparação de núcleos celulares. Após microdissecção e dissociação enzimática do tecido cardíaco em células únicas, as células progenitoras foram congeladas, seguidas pelo isolamento de células viáveis puras, que foram usadas para sequenciamento de RNA de núcleo único e o ensaio de núcleo único para cromatina acessível à transposase com análises de sequenciamento de alto rendimento.

Abstract

O coração em desenvolvimento é uma estrutura complexa contendo várias células progenitoras controladas por mecanismos regulatórios complexos. O exame da expressão gênica e do estado da cromatina de células individuais permite a identificação do tipo e estado celular. Abordagens de sequenciamento unicelular têm revelado uma série de características importantes da heterogeneidade de células progenitoras cardíacas. No entanto, esses métodos são geralmente restritos ao tecido fresco, o que limita estudos com diversas condições experimentais, pois o tecido fresco deve ser processado de uma só vez no mesmo período para reduzir a variabilidade técnica. Portanto, procedimentos fáceis e flexíveis para produzir dados de métodos como o sequenciamento de RNA de núcleo único (snRNA-seq) e o ensaio de núcleo único para cromatina acessível à transposase com sequenciamento de alto rendimento (snATAC-seq) são necessários nesta área. Aqui, apresentamos um protocolo para isolar rapidamente núcleos para núcleos únicos subsequentes dual-omics (snRNA-seq e snATAC-seq combinados). Este método permite o isolamento de núcleos de amostras congeladas de células progenitoras cardíacas e pode ser combinado com plataformas que utilizam câmaras microfluídicas.

Introduction

Dentre os defeitos congênitos, os defeitos cardíacos congênitos (DCC) são os mais comuns, ocorrendo em cerca de 1% dos nascidos vivos a cada ano 1,2. Mutações genéticas são identificadas em apenas uma minoria dos casos, implicando que outras causas, como anormalidades na regulação gênica, estão envolvidas na etiologia daCC2,3. O desenvolvimento cardíaco é um processo complexo de tipos celulares diversos e interagentes, tornando desafiadora a identificação de mutações causais não codificantes e seus efeitos na regulação gênica. A organogênese do coração....

Protocol

O procedimento animal adotado neste estudo foi aprovado pelos comitês de ética animal da Universidade Aix-Marseille (C2EA-14) e foi realizado de acordo com protocolos aprovados pelo comitê nacional de ética para experimentação animal (Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche; Autorização Apafis N°33927-2021111715507212).

1. Configurando o acasalamento cronometrado antes da dissecação

  1. Para gerar embriões de camun.......

Representative Results

Em comparação com a preparação de suspensões de célula única para abordagens de célula única, a preparação de suspensões de núcleo único é muito mais desafiadora e requer um maior grau de resolução e processamento. O fator chave para o sucesso da combinação combinada de snRNA-seq e snATAC-seq é uma suspensão de núcleos limpa e intacta. O protocolo para isolamento eficiente dos núcleos deve ser adaptado a cada tipo e condição de tecido (fresco ou congelado). Aqui, um protocolo otimizado é descrit.......

Discussion

A análise da composição celular do coração em desenvolvimento por meio de estudos combinados de snRNA-seq e snATAC-seq fornece uma compreensão mais profunda da origem da cardiopatiacongênita26. Vários laboratórios de pesquisa têm estudado os efeitos da criopreservação de tecido cardíaco no snRNA-seq27. A condução de snRNA-seq e snATAC-seq usando tecido fresco microdissecado de modelos murinos de doença humana pode ser logisticamente desafiadora quando se com.......

Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

Esta pesquisa foi apoiada por ERA-CVD-2019 e ANR-JCJC-2020 para SS. Agradecemos ao centro de Genômica e Bioinformática (GBiM) do laboratório U 1251/Marseille Medical Genetics e aos revisores anônimos por fornecerem comentários valiosos.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2100 Bioanalyzer InstrumentAgilentNo catalog number
5M Sodium chloride (NaCl)Sigma59222C-500ML 
BSA 10% SigmaA1595-50ML
Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns10X Genomics1000230
Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X)10X Genomics1000285
Countess cell counting chamber slidesInvitrogenC10283
Countess III FLThermofisherNo catalog number
Digitonin (5%)ThermofisherBN2006
DMSOSigmaD2650-5x5ML
DNA LoBind Tubes Eppendorf22431021
D-PBSThermofisher14190094Sterile and RNase-free
Dual Index Kit TT Set A 96 rxns10X Genomics1000215
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 352096
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 10788561
HI-FBSThermofisherA3840001Heat inactivated
High sensitivity DNA kitAgilent5067-4626
Igepal CA-630SigmaI8896-50ML
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity KitThermofisherL3224
MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20XMiltenyi Biotec130-090-101
MACS SmartStrainers (30 µm)Miltenyi Biotec130-098-458
Magnesium chloride (MgCl2)SigmaM1028-100ML
Milieu McCoy 5A Thermofisher16600082
MS ColumnsMiltenyi Biotec130-042-201
NovaSeq 6000 S2IlluminaNo catalog number
Penicillin Streptomycin (Pen/Strep)Thermofisher15070063
PluriStrainer Mini 40µmPluriSelectV-PM15-2021-12
Rock inhibitorEnzo Life SciencesALX-270-333-M005
Single Index Kit N Set A, 96 rxn10X Genomics1000212
Standard 90mm Petri dish SterilinThermofisher101R20
Sterile double-distilled waterThermofisherR0582
Trizma Hydrochloride solution (HCl)SigmaT2194-100ML 
Trypan Blue stain (0.4%)InvitrogenT10282
Trypsin 0.05% - EDTA 1XThermofisher25300054
Tween20SigmaP9416-50ML 
Wide orifice filtered pipette tips 200 μlLabcon1152-965-008-9
ZEISS SteREO Discovery.V8ZEISSNo catalog number

References

  1. vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews. Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
  2. Bouma, B. J., Mulder, B. J. Changing landscape of congenital heart disease. Circulation Re....

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