סדרה של טכניקות סינון לסקירה מהירה של פונקציית נויטרופיל

Summary

פרוטוקול זה כולל סדרה של בדיקות פונקציונליות נויטרופילים שישמשו כשיטת סינון לכיסוי פונקציות ממסלולי איתות שונים. הפרוטוקול כולל הערכה ראשונית ופשוטה של כדאיות התא, טוהר, ייצור מיני חמצן תגובתי, נדידה בזמן אמת, פגוציטוזה, והצעה ראשונית של מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים.

Abstract

נויטרופילים ידועים כאחד מקווי ההגנה הראשונים בתגובה החיסונית המולדת ויכולים לבצע תפקודים תאיים מסוימים רבים, כגון כימוטקסיס, הגירה הפוכה, פגוציטוזה, פירוק אנזימים ציטוטוקסיים ומטבוליטים, ושחרור דנ"א כמלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים (NET). נויטרופילים לא רק יש איתות מוסדר היטב עצמם, אלא גם להשתתף ברגולציה של רכיבים אחרים של המערכת החיסונית. מכיוון שנויטרופילים טריים נבדלים זה מזה, קצרי חיים ומשתנים מאוד בין אנשים, חשוב להפיק את המרב מהדגימות שנאספו. חוקרים לעתים קרובות צריכים לבצע בדיקות סקר כדי להעריך סקירה כללית של פונקציות נויטרופילים רבים שעשויים להיות מושפעים מתנאים ספציפיים תחת הערכה. סדרה של בדיקות בעקבות תהליך בידוד יחיד של נויטרופילים בצפיפות נורמלית פותחה כדי לענות על צורך זה, בחיפוש אחר איזון בין מהירות, מקיף, עלות ודיוק. התוצאות יכולות לשמש כדי לנמק ולהנחות מחקרי מעקב מעמיקים. הליך זה יכול להתבצע בזמן ממוצע של 4 שעות וכולל הערכה של כדאיות התא, ייצור מיני חמצן תגובתי (ROS), נדידה בזמן אמת ופאגוציטוזה של שמרים על שקופיות זכוכית, מה שמשאיר מספיק תאים לגישות מפורטות יותר כמו מחקרי אומיקס. יתר על כן, ההליך כולל דרך לצפות בקלות בהצעה ראשונית של NETs לאחר צביעה פנאופטית מהירה שנצפתה במיקרוסקופ אור, עם היעדר סמנים ספציפיים, אם כי מספיק כדי לציין אם מאמצים נוספים בדרך זו יהיו כדאיים. מגוון הפונקציות שנבדקו משלב נקודות משותפות בין הבדיקות, ומקטין את זמן הניתוח וההוצאות. ההליך נקרא NeutroFun Screen, ולמרות שיש לו מגבלות, הוא מאזן את הגורמים הנ"ל. יתר על כן, מטרת עבודה זו אינה סט בדיקות מוגדר, אלא קו מנחה שניתן להתאים בקלות למשאבים ולדרישות של כל מעבדה.

Introduction

נויטרופילים הם תאי החיסון המולדים הנפוצים ביותר בדם האנושי וידועים כממלאים תפקיד מרכזי בזיהום ובדלקת, בהיותם המגיבים הראשונים שהגיעו לאתר של נזק לרקמות¹. בשנים האחרונות גוברת ההכרה בתפקיד המכריע שממלאים נויטרופילים במגוון מחלות ובתמיכה בהומאוסטזיס². נויטרופילים לא רק יש איתות מוסדר היטב עצמם, אלא גם להשתתף ברגולציה של רכיבים אחרים של המערכת החיסונית ^3,4,5. לכן, חקירת נויטרופילים ותפקודיהם התאיים יוצאי הדופן הרבים, כגון כימוטקסיס, נדידה הפוכה⁶, פגוציטוזה⁷, התפרצות נשימתית

Protocol

כל הניסויים עקבו בקפדנות אחר ההנחיות האתיות שנקבעו על ידי ועדת הביקורת המוסדית באוניברסיטת ברזיליה (תהליך 13364819.0.0000.5558), והדגימות זוהו על ידי קודים כדי להבטיח את אנונימיות התורם. התאים נלקחו מתורמים זכרים בריאים רגילים בגילאי 18-35 שנים, שחתמו על ההסכמה מדעת ועמדו בתנאי הזכאות הבאים: לא מעשני.......

Discussion

נויטרופילים הם תאים דינמיים ומגיבים מאוד, קצרי חיים שעדיין לא ניתן לשמר אותם^{בהקפאה 19}, מה שהופך את חקירת הביולוגיה שלהם למאתגרת. לכן, חיוני לעקוב אחר צעדים זהירים כדי להשיג נויטרופילים קיימא, מועשר ומנוחה^11,20. במחקר זה נעשה שימוש בטכניקת בידוד מב?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CIM-Plate 16	Agilent	5665825001
CLARIOstar Plate Reader	BMG LABTECH		US Patent Number 9,733,124 Product details: MARS Data Analysis Software
Dimethyl sulfoxide	Dinâmica	1582
DNAse I	Sigma - Aldrich	DN 25
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Sigma - Aldrich	E5134
Fast panoptic stain	Laborclin	620529
Glass slide	Exacta	7102
Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red.	Sigma - Aldrich	55037C
Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate.	Sigma - Aldrich	H4641
Heparin	Blau	7896014655229
Laminar flow cabinet	Veco	VLFS-12
Microscope	Zeiss	415501-0101-002	Product details: Primostar 1
Mixing Block	BIOER	MB-102
Neubauer improved bright-lined	New Optik	1110000
N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine	Sigma - Aldrich	F3506
Nitroblue tetrazolium	Neon	CAS 298-83-9
Percoll	Cytiva	17089101	separation media
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma - Aldrich	P8139
Phosphate buffered saline tablet	Sigma - Aldrich	P4417
ROTOFIX 32 A	Hettich	1206
Saccharomyces cerevisiae	Fleischmann
Safranin	Sigma - Aldrich	50240
Sodium dodecyl sulfate	Cytiva	17-1313-01
Sonicator	Qsonica	Q125
Trypan blue solution	Vetec	C.I. 23850
Vortex Genie 2	Scientific Industries, Inc.	0K-0500-902
xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose)	Agilent	380601050	Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software