鳥類胚における左心房結紮術は、血管発生初期における血行動態負荷の変化のモデルとして

要約

ここでは、鳥類の胚で左心房結紮(LAL)モデルを実行するための詳細なビジュアルプロトコルを紹介します。LALモデルは、心臓内の流れを変化させ、壁のせん断応力負荷を変化させ、左心低形成症候群を模倣します。この困難なマイクロサージェリーモデルの課題を克服するためのアプローチが提示されます。

要約

鳥類の胚は、その4室の成熟した心室構成、培養の容易さ、画像アクセス、および効率性により、心血管の発達を研究するための脊椎動物モデルとして好まれています。正常な発達と先天性心疾患の予後を理解することを目的とした研究では、このモデルが広く採用されています。顕微鏡手術技術を導入して、特定の胚の時点で通常の機械的負荷パターンを変更し、下流の分子および遺伝子カスケードを追跡します。最も一般的な機械的介入は、左硝子体静脈結紮術、コノトランカルバンディング、および左心房結紮術(LAL)であり、血流による壁内血管圧と壁面せん断応力を調節します。LALは、特に ovoで実施された場合、最も困難な介入であり、非常に細かい逐次顕微鏡手術のために非常に小さなサンプル収量があります。その高いリスクにもかかわらず、 卵子では 、低形成性左心症候群(HLHS)の病因を模倣するため、科学的に非常に価値があります。HLHSは、ヒトの新生児に見られる臨床的に関連性のある複雑な先天性心疾患です。 in ovo LALの詳細なプロトコルは、この論文に記載されています。簡単に説明すると、受精した鳥類の胚は、通常、ハンバーガー・ハミルトン(HH)ステージ20〜21に達するまで、37.5°C、60%の一定湿度でインキュベートされました。卵の殻を割って開き、外膜と内膜を取り除きました。胚を緩やかに回転させて、総心房の左心房球を露出させた。10-0ナイロン縫合糸から事前に組み立てられたマイクロノットを静かに配置し、左心房芽の周りに結びました。最後に、胚を元の位置に戻して、LALが完成しました。正常心室とLALで計装された心室は、組織の圧縮に統計学的に有意な差を示しました。効率的なLALモデル生成パイプラインは、心血管コンポーネントの胚発生中の同期した機械的および遺伝的操作に焦点を当てた研究に貢献します。同様に、このモデルは、組織培養研究と血管生物学のための摂動細胞源を提供します。

概要

先天性心疾患(CHD)は、胚発生の異常によって起こる構造的疾患^です1。遺伝的状態に加えて、病因は機械的負荷の変化の影響を受けます^2,3。先天性心疾患である左心低形成症候群(HLHS)は^{、出生時に}心室/大動脈が未発達になり4、死亡率が高い^5,6。その臨床管理の最近の進歩にもかかわらず、HLHSの血管の成長と発達のダイナミクスはまだ不明です⁷。正常な胚発生では、左心室(LV)心内膜および心筋は、初期胚性心臓管形成が進行するにつれて心臓前駆細胞に由来する。心筋線維柱帯、肥厚層、および心筋細胞増殖の段階的な^{存在が報告されています}2。HLHSでは、線維柱帯リモデリングの変化と左心室の平坦化が観察され、異常な心筋細胞の移動による心筋形成不全にさらに寄与します2,8,9,10

心臓の発達を研究し、血行動態を理解するために広く使用されているモデル生物¹¹の中で、鳥類の胚は、その4室の成熟した心臓と培養の容易さのために好まれています11,12,13,14。一方、ゼブラフィッシュの胚とトランスジェニック/ノックアウトマウスの高度なイメージングアクセスには、明確な利点があります^11,12。鳥類の胚に対して、心血管成分の発達における壁内圧と壁せん断応力を変化させるさまざまな機械的介入がテストされています。これらのモデルには、左硝子体結紮術、コノトランカルバンディング¹⁵、および左心房結紮術(LAL)^11,12,16が含まれます。機械的負荷の変化による結果の表現型は、早期予後に焦点を当てた研究における外科的介入の約24〜48時間後に観察できます^11,13。LAL介入は、房室開口部の周囲に縫合糸ループを配置することにより、左心房(LA)の機能容積を狭める一般的な技術です。同様に、右心房結紮術(RAL)を標的とする顕微外科的介入も行われている^17,18。同様に、一部の研究者は、LA^19,20の体積を減らすために、マイクロクリップを使用して左心耳(LAA)を標的としています。いくつかの研究では、外科用ナイロン糸が房室リンパ節^19,21に適用される。使用される介入の 1 つは LAL で、HLHS を模倣できますが、非常に細かい顕微鏡手術が必要なため、サンプル収量が非常に少ないため、実行が最も難しいモデルでもあります。私たちの研究室では、LALはハンバーガーハミルトン(HH)ステージ20と21の間の卵子で行われ、総心房が完全に中^隔6,14,22,23になる前です。LAの周囲に外科的縫合糸を配置し、心臓内血流を変化させます。HLHSのLALモデルでは、心室壁の剛性の増加、筋線維の角度の変化、およびLV腔サイズの減少が観察されます^14,24。

このビデオ記事では、 in ovo LALの詳細なプロトコルとアプローチが提供されています。簡単に言うと、受精した鳥類の胚を顕微鏡手術のためにインキュベートし、卵殻を割って開き、外膜と内膜をきれいにしました。その後、胚をゆっくりと回転させて、LAにアクセスできるようにしました。10-0ナイロン製の外科的縫合糸を心房芽に結び付け、胚を元の向きに戻して、LAL手順²⁵を完了しました。LALと正常心室は、光干渉断層撮影法と基本的な組織学 を介して 、組織の圧縮と心室容積について比較されます。

本稿で説明したように、LALモデルパイプラインの運用に成功すれば、心血管系成分の胚発生に焦点を当てた基礎研究に貢献することが期待されます。このモデルは、遺伝子操作や高度なイメージングモダリティと組み合わせて使用することもできます。同様に、急性LALモデルは、組織培養実験のための病変血管細胞の安定した供給源です。

プロトコル

受精可能な白いレグホーンの卵は、信頼できるサプライヤーから入手し、大学が承認したガイドラインに従って孵化させます。ニワトリ胚、ステージ18(3日目)から24日目(4日目)(この論文で提示されたステージ)は、欧州連合(EU)指令2010/63 / EUおよび米国の施設動物管理および使用委員会(IACUC)ガイドラインでは生きた脊椎動物とは見なされません。ニワトリの胚は、米国の法律では孵化19日目以降に「生きた動物」とみなされますが、EUではそうではありません。各卵には孵化開始日が記載されており、孵化の10^日目 までに孵化する予定です。卵が孵化した後、ひよこは孵卵器から取り出されます。このプロトコルは、2つのベンチトップ操作ステーション(ステーション1とステーション2)で実行され、特殊なモデル生成段階に焦点を当てています。

1.マイクロサージェリー前の準備

1. 受精卵は、特定の病原体フリー(SPF)グレードのワクチン開発センターから、または信頼できる商業サプライヤーの農場を通じて、乾燥したポリスチレン容器に入った壊れやすい宅配便業者で入手してください。インキュベーションする前に、70%エタノールに浸した糸くずの出ないワイプで卵殻をやさしく洗浄し、汚染を取り除きます。
2. 胚の包含/除外基準
   1. 輸送中にひびが入ったり損傷したりした卵は孵化させないでください。
   2. LAL手順中または再インキュベーション後に出血が認められた場合は、胚を使用しないでください。
   3. 血行動態の血流が通常の向きと異なる可能性があるため、左側を上にした状態で発育する胚は使用しないでください。
   4. 術前と術後の両方の処置で先天性欠損を伴うDıscard胚。
   5. HLHSをLALモデルとして模倣して、元の場所で発育する標的段階に達した胚を含めます。
3. 受精したホワイトレグホーンニワトリ卵(Gallus gallus domesticus L.)を、平滑な末端で、通常はHH20-21¹⁵ (37.5°C、湿度60%、3.5日)で目的の段階までインキュベートします(図1)。
   注意: 収量を増やすには、卵を一定の温度と湿度に保つことが重要です。インキュベーターのモデルによっては、蒸留水で満たされた鍋を追加すると、安定した湿度が維持されます。ほとんどのインキュベーターに適合する追加/補助の温度および湿度制御システムの青写真は、著者によって開発され、推奨されています。この自社製のセンサ/制御ユニットの電子回路、ハードウェア、およびコードの詳細は、データリポジトリ²⁶で提供されます。孵化中に卵を穏やかに振る(回転させる)ことで、胚の最適な配置が可能になり、「手術可能な」胚の割合が高くなる可能性があります。振とうは、この容量を持つインキュベーターでも機能し、生産性をさらに向上させることができます。
4. 手順を開始する前に、緩いオーバーハンドノットを長さ1.5cmの10-0縫合糸に結び付けて、必要な数の結び目を準備します。結び目がきつくなく、手術中に心房に簡単にフィットするのに十分な大きさであることを確認してください(図2)。
   注意: 事前に結び目を結び、使用する前に滅菌ひよこリンガー溶液に保管してください。結び目を作る作業では、ピンセットを同期して操作するために両手を使用する必要があります。これはプロトコルの重要な段階であるため、このステップを練習するためのパテから心房のモデルを作成できます(図3)。これにより、ステーション 2 でステップ 3.2.3 を実行するために必要な 3 次元マイクロサージェリーのスキルが向上します (図 4)。

2. ステーション1での運用(図4A)

1. 卵の鈍い端から窓を開け、外膜と内膜の両方を除去する¹⁵(図5A-D)。
2. ピンセットの裏側で軽く割って卵の殻を開き、自由な指で卵をしっかりと支えて、不要な亀裂の伝播を減らします。
3. LALは長時間の処置であるため、心拍数は温度に依存するため、胚の温度と湿度を温存してください。したがって、最初のシェルウィンドウは、操作を実行するのに十分な大きさで、できるだけ小さく作成してください。
   注:動作中に湿度または温度制御システムは採用されませんが、これらのシステムがあれば、歩留まりが向上します。可能であれば、ラボの空調システムをシャットダウンし、可能な限り高い室温(RT)で手順を実行します。手術中の胎児の心拍数は、温度によって制御できる最適化も推奨されます。一部の検査室では、LAL操作中に温度制御 により 、心拍数を120bpmよりわずかに低いレートに維持しています。そのため、手術部位の周囲で湿度をコントロールすることで、歩留まりをさらに高めることができます。卵殻の窓はできるだけ小さく、外科手術が入るのに十分な大きさになっています。これは厚い外膜にも当てはまり、通常、卵殻よりも小さいのは胚の円周の範囲だけです。これらは、胚の温度と湿度を維持することを保証します。卵の鈍い端から窓を開けながら、小さな殻の破片を洗浄して、これらの破片が硝子体の血管の完全性を損なったり、不要なアーチファクトを引き起こしたりしないようにします。また、他の研究室では、湾曲したマイクロセレーションハサミを使って窓を作っています。また、2幅のセロハンテープを使用して卵殻を安定させ、ひび割れを抑えることができます。
4. 必要なビテリン膜だけをマイクロハサミで除去します(補足動画1)。
5. 正常な胚発生は右側を上にしています。胚が硝子膜から解放されたら、先端が閉じたピンセットを胚の背側部分の下に置き、胚を静かに裏返して左側を露出させます(つまり、左側を上にした構成)(図6A、B; 補足動画2)。
6. 左心房芽が露出しているが、通常は心膜の二重層からなる複雑な膜システムで覆われていることを確認します。
7. 心房芽の周りの膜を、細かいものも含めてすぐに取り除きます。これも重要な段階です。粗い膜から膜を取り除き、左心房芽の周りの細かい膜へと進みます。細かい膜を除去するために、最高級のピンセットを予約します(補足ビデオ3)。
8. 膜除去プロセス中に、胚を左側を上にした位置に向け、ステップ3.2の結び目配置操作をそれ以上の再配置なしで実行できるようにします。これを行うには、ステップ2.6のメンブレンを使用して胚を持ち上げ、左側が上を向くように卵殻から吊るします。
   注:一部の胚は卵殻の周辺部の近くに配置でき、操作が困難な場合があります。それでも、これらの胚は右側を上に向け、正常な行動を示す可能性が高く、研究に含めることができます。このような場合、必要に応じて、#4の細いピンセットで心膜を優しく洗浄し、卵殻を逆方向(殻の開口部に向かって)取り除くことで、不明瞭な心房にアクセスしやすくすることができます。これらの胚は、胚外膜の一部を使用して持ち上げ、膜の一端(ピンセットの端)を卵殻に取り付けることによって、その自然な粘着性を利用して目的の位置に固定することもできます。さらに、胚の頭部と脊髄領域の間の空間は、ピンセットの助けを借りて拡張し、不明瞭な心房を明らかにすることができます。

3. ステーション2での運用(図4B)

1. 実体顕微鏡下で、ステップ1.4で事前に準備した結び目を、アクセス可能な場所の胚の近くに配置します(図6B)。これで、心房芽を縛る準備が整いました(補足動画4)。
2. 事前に準備したオープンノットを取り出し、左心房芽に向けます。LALを機能させるには、卵を独自の傾斜した3次元方向に置きます。
   1. 胚を傷つけずに締め付けプロセスを実行するために、結び目を正しく向けます。
   2. ステップ2.7で微細な膜を最適に除去し、心臓の鼓動の影響を軽減します。
   3. 縫合糸を締めます(図6C)。このステップでは、パテで練習すると非常に便利です。偽胚の場合は、結び目を保持するのに十分なだけ結び目を締めます。
3. 次に、マイクロハサミを使用して、縫合糸の余分な端をつぼみにできるだけ近づけて切ります(補足ビデオ5)。
4. 結ばれた縫合糸の新しく切断された端が、回転中または心拍のために近くの血管に穴を開ける位置にないように十分に注意してください。
5. ピンセットを使用して、手順3.3で切り取った余分な縫合糸片を取り除きます。
6. 最後に、閉じたピンセットを使用して、ステップ2.5(補足ビデオ6)のように、胚を元の位置に戻します。
7. LALプロセスが完了したら、卵をパラフィルムの二重層で覆い、再度インキュベートします。卵をしっかりと無菌で閉じることは、特に孵化の24時間以降の生存にとって最も重要です。目視でもアクセスしたい場合は、スライドガラスにパラフィンワックスを使用してください。
   注:初期胚期が研究されているように、卵は通常、約HH25またはHH27に達するまで24〜48時間孵化します。しかし、限界はなく、他の研究者が試みたように、後の段階を研究することができます。操作速度を速くするには、少なくとも2人のチームをお勧めします。1人は、左心房芽の周りの卵の開卵、最初の膜のクリーンアップ、回転、および膜のクリーンアップの訓練を受け、責任を負う必要があります。相手は、最初の結び目の準備、結び目の配置、締め付けのみを担当します。最終胚の回転は、人1が行うことができる。単一の胚の外科手術には約4〜5分かかります。
8. 外科手術の前後に、ベンチトップの表面と器具をエタノールで洗浄してください。新鮮なひよこリンガー溶液(NaCl、KCl、CaCl₂、およびNaHCO₃)^16,27を、胚組織に触れる金属器具に必ず適用してください。

結果

高度な時間分解イメージング技術を使用して、LAL介入による構造的および形態学的変化を観察することができる¹⁰。さらに、LAL試料は分子生物学的方法にも従順である^19,28。表1に、LALモデルの結果を採用したサンプル研究が提供されています。これに関連して、LAL介入はHH20-21に達したニワトリ胚で行われました。対照...

ディスカッション

HLHSでは、構造的欠陥により血流が変化し、左側に異常な形態が生じます^4,6。本モデルは、HLHSの進行をよりよく理解するための実用的な実験システムを提供し、その病因を模倣することさえできる^{かもしれません8。}しかし、完全に臨床的に同等のHLHS動物モデルを確立することは困難な作業です。ここで紹介した鳥類のLALモデルに?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 nylon surgical suture	Ethicon
Elastica van Gieson staining kit	Sigma-Aldrich	115974	For staining connective tissues in histological sections
Ethanol absolute	Interlab	64-17-5	For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water.
Incubator	KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A	AZYSS600-110
Kimwipes	Interlab	080.65.002
Microscissors	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	555640S	Vannas STR 82 mm
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	Sealing stage for egg reincubation
Paraplast Bulk	Leica Biosystems	39602012	Tissue embedding medium
Stereo Microscope	Zeiss Stemi 508	Stemi 508	Used at station 1
Stereo Microscope	Zeiss Stemi 2000-C	Stemi 2000-C	Used at station 2
Tweezer (Dumont 4 INOX #F4)	Adumont & Fils, Switzerland		Used to return the embryo
Tweezer (Super Fine Dumont #5SF)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	501985	Used to remove the membranes on the embryo