鳥類胚における左心房結紮術は、血管発生初期における血行動態負荷の変化のモデルとして

要約

ここでは、鳥類の胚で左心房結紮(LAL)モデルを実行するための詳細なビジュアルプロトコルを紹介します。LALモデルは、心臓内の流れを変化させ、壁のせん断応力負荷を変化させ、左心低形成症候群を模倣します。この困難なマイクロサージェリーモデルの課題を克服するためのアプローチが提示されます。

要約

鳥類の胚は、その4室の成熟した心室構成、培養の容易さ、画像アクセス、および効率性により、心血管の発達を研究するための脊椎動物モデルとして好まれています。正常な発達と先天性心疾患の予後を理解することを目的とした研究では、このモデルが広く採用されています。顕微鏡手術技術を導入して、特定の胚の時点で通常の機械的負荷パターンを変更し、下流の分子および遺伝子カスケードを追跡します。最も一般的な機械的介入は、左硝子体静脈結紮術、コノトランカルバンディング、および左心房結紮術(LAL)であり、血流による壁内血管圧と壁面せん断応力を調節します。LALは、特に ovoで実施された場合、最も困難な介入であり、非常に細かい逐次顕微鏡手術のために非常に小さなサンプル収量があります。その高いリスクにもかかわらず、 卵子では 、低形成性左心症候群(HLHS)の病因を模倣するため、科学的に非常に価値があります。HLHSは、ヒトの新生児に見られる臨床的に関連性のある複雑な先天性心疾患です。 in ovo LALの詳細なプロトコルは、この論文に記載されています。簡単に説明すると、受精した鳥類の胚は、通常、ハンバーガー・ハミルトン(HH)ステージ20〜21に達するまで、37.5°C、60%の一定湿度でインキュベートされました。卵の殻を割って開き、外膜と内膜を取り除きました。胚を緩やかに回転させて、総心房の左心房球を露出させた。10-0ナイロン縫合糸から事前に組み立てられたマイクロノットを静かに配置し、左心房芽の周りに結びました。最後に、胚を元の位置に戻して、LALが完成しました。正常心室とLALで計装された心室は、組織の圧縮に統計学的に有意な差を示しました。効率的なLALモデル生成パイプラインは、心血管コンポーネントの胚発生中の同期した機械的および遺伝的操作に焦点を当てた研究に貢献します。同様に、このモデルは、組織培養研究と血管生物学のための摂動細胞源を提供します。

概要

先天性心疾患(CHD)は、胚発生の異常によって起こる構造的疾患^です1。遺伝的状態に加えて、病因は機械的負荷の変化の影響を受けます^2,3。先天性心疾患である左心低形成症候群(HLHS)は^{、出生時に}心室/大動脈が未発達になり4、死亡率が高い^5,6。その臨床管理の最近の進歩にもかかわらず、HLHSの血管の成長と発達のダイナミクスはまだ不明です⁷。正常な胚発生では、左心室(LV)心内膜および心筋は、初期胚性心臓管形成が進行するにつれて心臓前駆細胞に由来する。心筋線維柱帯、肥厚層、および心筋細胞増殖の段階的な^{存在が報告されています}2。HLHSでは、線維柱帯リモデリングの変化と左心室の平坦化が観察され、異常な心筋細胞の移動による心筋形成不全にさらに寄与します2,8,9,10

プロトコル

受精可能な白いレグホーンの卵は、信頼できるサプライヤーから入手し、大学が承認したガイドラインに従って孵化させます。ニワトリ胚、ステージ18(3日目)から24日目(4日目)(この論文で提示されたステージ)は、欧州連合(EU)指令2010/63 / EUおよび米国の施設動物管理および使用委員会(IACUC)ガイドラインでは生きた脊椎動物とは見なされません。ニワトリの胚は、米国の法律では孵化19日目以降に「生きた動物」とみなされますが、EUではそうではありません。各卵には孵化開始日が記載されており、孵化の10^日目 までに孵化する予定です。卵が孵化した後、ひよこは孵卵器から取り出されます。このプロトコルは、2つのベンチトップ操作ステーション(ステーション1とステーション2)で実行され、特殊なモデル生成段階に焦点を当てています。

1.マイクロサージェリー前の準備

1. 受精卵は、特定の病原体フリー(SPF)グレードのワクチン開発センターから、または信頼できる商業サプライヤーの農場を通じて、乾燥したポリスチレン容器に入った壊れやすい宅配便業者で入手してください。インキュベーションする前に、70%エタノールに浸した糸くずの出ないワイプで卵殻をやさしく洗浄し、汚染を取り除きます。
2. 胚の包含/除外基準
   1. 輸送中にひびが入ったり損傷したりした卵は孵化させないでください。
   2. L....

結果

高度な時間分解イメージング技術を使用して、LAL介入による構造的および形態学的変化を観察することができる¹⁰。さらに、LAL試料は分子生物学的方法にも従順である^19,28。表1に、LALモデルの結果を採用したサンプル研究が提供されています。これに関連して、LAL介入はHH20-21に達したニワトリ胚で行われました。対照.......

ディスカッション

HLHSでは、構造的欠陥により血流が変化し、左側に異常な形態が生じます^4,6。本モデルは、HLHSの進行をよりよく理解するための実用的な実験システムを提供し、その病因を模倣することさえできる^{かもしれません8。}しかし、完全に臨床的に同等のHLHS動物モデルを確立することは困難な作業です。ここで紹介した鳥類のLALモデルに?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 nylon surgical suture	Ethicon
Elastica van Gieson staining kit	Sigma-Aldrich	115974	For staining connective tissues in histological sections
Ethanol absolute	Interlab	64-17-5	For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water.
Incubator	KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A	AZYSS600-110
Kimwipes	Interlab	080.65.002
Microscissors	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	555640S	Vannas STR 82 mm
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	Sealing stage for egg reincubation
Paraplast Bulk	Leica Biosystems	39602012	Tissue embedding medium
Stereo Microscope	Zeiss Stemi 508	Stemi 508	Used at station 1
Stereo Microscope	Zeiss Stemi 2000-C	Stemi 2000-C	Used at station 2
Tweezer (Dumont 4 INOX #F4)	Adumont & Fils, Switzerland		Used to return the embryo
Tweezer (Super Fine Dumont #5SF)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	501985	Used to remove the membranes on the embryo