Estabelecendo culturas mistas de células neuronais e gliais de cérebros embrionários de camundongos para estudar infecção e imunidade inata

Summary

Este protocolo apresenta uma maneira única de gerar culturas de células do sistema nervoso central a partir de cérebros embrionários de camundongos do dia 17 para pesquisa em neuro(imuno)logia. Este modelo pode ser analisado usando várias técnicas experimentais, incluindo RT-qPCR, microscopia, ELISA e citometria de fluxo.

Abstract

Modelos do sistema nervoso central (SNC) devem recapitular a complexa rede de células interconectadas encontradas in vivo. O SNC consiste principalmente de neurônios, astrócitos, oligodendrócitos e micróglia. Devido aos crescentes esforços para substituir e reduzir o uso animal, uma variedade de sistemas de cultura de células in vitro tem sido desenvolvida para explorar propriedades celulares inatas, que permitem o desenvolvimento de terapêuticas para infecções e patologias do SNC. Embora certas questões de pesquisa possam ser abordadas por sistemas de cultura de células baseados em humanos, como células-tronco pluripotentes (induzidas), trabalhar com células humanas tem suas próprias limitações em relação à disponibilidade, custos e ética. Aqui, descrevemos um protocolo único para isolar e cultivar células de cérebros embrionários de camundongos. As culturas de células neurais mistas resultantes imitam várias populações de células e interações encontradas no cérebro in vivo. Em comparação com os métodos equivalentes atuais, este protocolo imita mais de perto as características do cérebro e também ganha mais células, permitindo assim que mais condições experimentais sejam investigadas a partir de uma rata grávida. Além disso, o protocolo é relativamente fácil e altamente reprodutível. Essas culturas foram otimizadas para uso em várias escalas, incluindo telas de alto rendimento baseadas em 96 poços, análise de microscopia de 24 poços e culturas de 6 poços para citometria de fluxo e análise de reação em cadeia da polimerase quantitativa com transcrição reversa (RT-qPCR). Este método de cultura é uma ferramenta poderosa para investigar infecção e imunidade dentro do contexto de alguma complexidade do SNC com a conveniência de métodos in vitro .

Introduction

Melhorar nossa compreensão do sistema nervoso central (SNC) é fundamental para melhorar as opções terapêuticas para muitas doenças neuroinflamatórias e neurodegenerativas. O SNC, uma rede complexa de células interconectadas dentro do cérebro, medula espinhal e nervos ópticos, compreende neurônios, oligodendrócitos, astrócitos e suas células imunes inatas, a microglia¹. Uma abordagem in vitro pode muitas vezes reduzir drasticamente o número de camundongos necessários para realizar pesquisas significativas; no entanto, a natureza complexa do SNC torna impossível recapitular a situação in vivo usando linhagens celulares. Culturas....

Protocol

Todos os experimentos com animais cumpriram as leis e diretrizes locais para uso de animais e foram aprovados pelo Comitê de Revisão Ética local da Universidade de Glasgow. Os animais foram alojados em condições específicas livres de patógenos de acordo com o UK Animals Scientific Procedures Act 1986, sob os auspícios de uma Licença de Projeto do Ministério do Interior do Reino Unido. Para este estudo, foram utilizados camundongos C57BL/6J adultos criados internamente. O uso de fêmeas jovens (8-12 semanas) é .......

Discussion

O SNC é uma rede complexa que se estende do cérebro até a medula espinhal e consiste de vários tipos celulares, predominantemente neurônios, oligodendrócitos, astrócitos e microglia¹. Como cada célula tem um papel importante na manutenção da homeostase e na geração de respostas adequadas aos desafios no SNC 9,10,11^, um sistema de cultura que contenha todos esses tipos celulares é uma ferramenta útil e versátil pa.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Trypsin	Sigma	T4549-100ML	To digest tissue
140 mm TC Dish	Fisher	11339283	Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish
15 mL Falcon	Sarstedt	62554502	To collect cells into pellet for resuspension in plating media
18 G needle	Henke Sass Wolf	4710012040	For trituration of sample
21 G needle	BD	304432	For trituration of sample
23 G needle	Henke Sass Wolf	4710006030	For trituration of sample
35 mm TC Dish	Corning	430165	Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish
5 mL syringe	Fisher	15869152	For trituration of sample
6 well plate	Corning	3516	To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry
7 mL Bijoux	Fisher	DIS080010R	To put brains intp
96 well plate	Corning	3596	To plate out cells for high-throughput testing
ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE	Miltenyi	130-123-284	For flow cytometry staining of astrocytes
Angled forceps	Dumont	0108-5/45-PO	For dissection
Biotin	Sigma	B4501	For DM+/-
Boric Acid	Sigma	B6768-500G	For boric acid buffer
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69	Biolegend	101825	For flow cytometry staining of neurons and astrocytes
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11	Biolegend	103139	For flow cytometry staining of microglia
Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70	Biolegend	101243	For flow cytometry staining of microglia
BSA Fraction V	Sigma	A3059-10G	For SD Inhibitor
CNP	Abcam	AB6319	Mature oligodendrocytes
Coverslip	VWR	631-0149	To plate out cells for microscopy
Dissection Scissors	Sigma	S3146-1EA	For dissection
DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine	Gibco	21969-035	For DM+/-, and for plating media
DNase I	Thermofisher	18047019	For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma
DNase I	Sigma	D4263	For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780	Thermofisher	65-0865-14	Live / Dead stain
Fine forceps	Dumont	0102-SS135-PO	For dissection
GFAP	Invitrogen	13-0300	Astrocytes
HBSS w Ca Mg	Sigma	H9269-500ML	For plating media
HBSS w/o Ca Mg	Sigma	H9394-500ML	For brains to be added to
Horse Serum	Gibco	26050-070	For plating media
Hydrocortisone	Sigma	H0396	For DM+/-
Iba1	Alpha-Laboratories	019-1971	Microglia
Insulin	Sigma	I1882	For DM+
Leibovitz L-15	GIbco	11415-049	For SD Inhibitor
MBP	Bio-Rad	MCA409S	Myelin
Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit	BioTechne	DY478-05	ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate
N1 media supplement	Sigma	N6530-5ML	For DM+/-
Nestin	Merck	MAB353	Neuronal stem/progenitor cells
NeuN	Thermofisher	PA578499	Neuronal cell body
NG2	Sigma	AB5320	Immature oligodendrocytes
O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC	Miltenyi	130-119-155	For flow cytometry staining of oligodendrocytes
Pen/Strep	Sigma	P0781-100ML	For DM+/-, and for plating media
Poly-L-Lysinehydrobromide	Sigma	P1274	For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips
SMI31	BioLegend	801601	Axons
Sodium Tetraborate	Sigma	221732-100G	For boric acid buffer
Trizol	Thermofisher	15596026	For lysing cells for RT-qPCR
Trypsin inhibitor from soybean	Sigma	T9003-100MG	For SD Inhibitor