Establecimiento de cultivos mixtos de células neuronales y gliales a partir de cerebros embrionarios de ratones para estudiar la infección y la inmunidad innata

Resumen

Este protocolo presenta una forma única de generar cultivos celulares del sistema nervioso central a partir de cerebros embrionarios de ratón del día 17 para la investigación neuro(inmuno)lógica. Este modelo se puede analizar utilizando varias técnicas experimentales, incluyendo RT-qPCR, microscopía, ELISA y citometría de flujo.

Resumen

Los modelos del sistema nervioso central (SNC) deben recapitular la compleja red de células interconectadas que se encuentran in vivo. El SNC consiste principalmente en neuronas, astrocitos, oligodendrocitos y microglía. Debido a los crecientes esfuerzos para reemplazar y reducir el uso de animales, se han desarrollado una variedad de sistemas de cultivo celular in vitro para explorar las propiedades celulares innatas, que permiten el desarrollo de terapias para infecciones y patologías del SNC. Si bien ciertas preguntas de investigación pueden ser abordadas por sistemas de cultivo celular basados en humanos, como las células madre pluripotentes (inducidas), trabajar con células humanas tiene sus propias limitaciones con respecto a la disponibilidad, los costos y la ética. Aquí, describimos un protocolo único para aislar y cultivar células de cerebros embrionarios de ratones. Los cultivos celulares neuronales mixtos resultantes imitan varias poblaciones celulares e interacciones que se encuentran en el cerebro in vivo. En comparación con los métodos equivalentes actuales, este protocolo imita más de cerca las características del cerebro y también obtiene más células, lo que permite investigar más condiciones experimentales de un ratón preñado. Además, el protocolo es relativamente fácil y altamente reproducible. Estos cultivos se han optimizado para su uso en varias escalas, incluidas las pantallas de alto rendimiento basadas en 96 pocillos, el análisis de microscopía de 24 pocillos y los cultivos de 6 pocillos para citometría de flujo y análisis de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR). Este método de cultivo es una herramienta poderosa para investigar la infección y la inmunidad dentro del contexto de algunas de las complejidades del SNC con la conveniencia de los métodos in vitro .

Introducción

Mejorar nuestra comprensión del sistema nervioso central (SNC) es fundamental para mejorar las opciones terapéuticas para muchas enfermedades neuroinflamatorias y neurodegenerativas. El SNC, una compleja red de células interconectadas dentro del cerebro, la médula espinal y los nervios ópticos, comprende neuronas, oligodendrocitos, astrocitos y sus células inmunes innatas, la microglía¹. Un enfoque in vitro a menudo puede reducir drásticamente el número de ratones necesarios para realizar una investigación significativa; sin embargo, la naturaleza compleja del SNC hace imposible recapitular la situación in vivo utilizando líneas celulares. Los cultivos celulares neuronales mixtos proporcionan una herramienta de investigación extremadamente valiosa para investigar cuestiones de neuro(inmuno)logía en un modelo relevante, en línea con los principios de Reemplazo, Reducción y Refinamiento (3R) ^2,3.

Thomson et al. describieron un método de cultivo celular utilizando células de la médula espinal prenatal que se diferencian en todos los tipos principales de células del SNC antes mencionados⁴. Este sistema también tiene formación de sinapsis, axones mielinizados y nodos de Ranvier. La principal limitación de este método de cultivo es que, al ser la médula espinal, no modela de manera útil el cerebro, y los rendimientos celulares de la médula espinal del día embrionario 13 (E13) son constrictivos. Por lo tanto, esto limita el número de condiciones experimentales que se pueden investigar. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo desarrollar un nuevo sistema de cultivo celular que recapitule las características del cerebro con un mayor rendimiento celular para reducir los requisitos de los animales.

Usando Thomson et al. como punto de partida, desarrollamos un modelo de cultivo celular derivado puramente de cerebros de ratones prenatales. Estos cultivos tienen las mismas poblaciones celulares, interconectividad y opciones de tratamiento que los cultivos de la médula espinal, excepto que hay menos mielinización en comparación. Sin embargo, tener un modelo in vitro del SNC con un rendimiento celular aproximadamente tres veces mayor es más eficiente, ya que requiere menos ratones y menos tiempo procesando embriones. Optimizamos este sistema de cultivo único para múltiples aplicaciones y escalas aguas abajo, incluido el uso de cubreobjetos de vidrio para el análisis de microscopía y varios tamaños de placas de pozos de plástico, incluidas placas de 96 pocillos para investigación de alto rendimiento.

Protocolo

Todos los experimentos con animales cumplieron con las leyes y pautas locales para el uso de animales, y fueron aprobados por el Comité de Revisión Ética local de la Universidad de Glasgow. Los animales fueron alojados en condiciones específicas libres de patógenos de acuerdo con la Ley de Procedimientos Científicos de Animales del Reino Unido de 1986, bajo los auspicios de una Licencia de Proyecto del Ministerio del Interior del Reino Unido. Para este estudio, se utilizaron ratones adultos C57BL / 6J criados internamente. Se recomienda el uso de mujeres jóvenes (8-12 semanas) debido a la mayor tasa de éxito del embarazo; Los machos pueden ser reutilizados para múltiples rondas de reproducción. La Figura 1 representa una descripción esquemática del método descrito para generar cultivos neuronales y gliales mixtos.

1. Preparación de los consumibles de cultivo de tejidos

1. Prepare los platos y/o platos que contengan cubreobjetos de microscopía dentro de un gabinete de seguridad de Clase 2. Esterilizar todos los reactivos o autoclaves para asegurar la esterilidad durante el período de cultivo.
2. Agregue el volumen apropiado de BA-PLL (13.2 μg/mL poli-L-lisinahidrobromuro [PLL] en tampón de ácido bórico [BA] [50 mM de ácido bórico, 12.5 mM de tetraborato de sodio, pH 8.5]; ver Tabla de materiales) a cada pocillo (1,000 μL/pocillo en una placa de 6 pocillos, 100 μL/pocillo en una placa de 96 pocillos; los volúmenes se resumen en la Tabla 1). Para los cubreobjetos de microscopía, agregue 20 ml de BA-PLL a una placa de cultivo de tejidos de 9 cm de diámetro que contenga 200 cubreobjetos estériles y agite para distribuir uniformemente.
3. Incubar a 37 °C durante 1-2 h.
4. Retire la solución de BA-PLL de cada pocillo o plato que contenga cubreobjetos de microscopía y lávelos agregando 20 ml de agua estéril, agitando los cubreobjetos y luego retirando el agua. Repita este paso de lavado tres veces. Para un plato que contiene cubreobjetos, deje agua estéril en el plato de cultivo de tejidos en el lavado final para quitar fácilmente los cubreobjetos.
5. Retire la mayor cantidad de líquido posible con una pipeta estéril y deje secar durante al menos 2 h durante toda la noche.
6. Conservar las placas recubiertas a 4 °C durante un máximo de 2 meses.
   NOTA: La solución de ácido bórico preparado con poli-l-lisina (BA-PLL) se puede reutilizar hasta tres veces, agregando nueva PLL cada vez. Conservar el BA-PLL a 4 °C. Los platos se tratan con BA-PLL, ya que el PLL permite que las células se peguen y crezcan. Sin este tratamiento, las células se levantarán después de aproximadamente 1 semana de cultivo y ya no podrán diferenciarse.

2. Disección de cerebros embrionarios E17

1. Co-casa uno o varios ratones hembra con un ratón macho. Revise a las hembras diariamente para ver si hay un tapón de moco, lo que indica que se ha producido el apareamiento.
   NOTA: Cualquier ratón hembra "tapado" debe separarse del macho para garantizar la fecha correcta de inicio de la gestación. Los ratones pueden ser pesados para confirmar el embarazo o monitoreados visualmente.
2. Sacrificar a la ratona preñada en E17 utilizando métodos apropiados de acuerdo con las directrices y leyes locales de bienestar animal, por ejemplo, aumentando la concentración de dióxido de carbono (CO₂), una sobredosis de anestesia letal o la dislocación del cuello.
   NOTA: El método elegido no debe interrumpir los embriones. Para este estudio, la exposición a una concentración creciente de gas de dióxido de carbono seguida de la confirmación de la muerte por corte de la arteria femoral se utilizó para sacrificar a las madres embarazadas.
3. Coloque el ratón preñado sacrificado sobre su espalda en una tabla de disección; Si bien no es necesario fijarlo, podría hacerlo más fácil para los investigadores sin experiencia. Pellizque la línea media del abdomen con fórceps. Con unas tijeras afiladas, abra el abdomen a través de la piel y el peritoneo sobre la línea media desde los genitales hasta la caja torácica, teniendo cuidado de no perforar el útero.
   1. El útero del ratón tiene dos cuernos, cada uno típicamente contiene de uno a cinco embriones. Retire el útero que contiene los embriones de la madre e inmediatamente colóquelo en hielo.
4. Corte a través del saco vitelino en el lado de las placentas, teniendo cuidado de no dañar los embriones, y retire los embriones de su saco vitelino.
5. Decapitar inmediatamente los embriones. Agregue las cabezas decapitadas en un plato con la solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) sin calcio (Ca 2+) y magnesio (Mg²⁺) (HBSS-/-) en hielo.
   NOTA: Si se requiere genotipado, se puede quitar la cola en esta etapa para el análisis genético. Cuando se esperan múltiples genotipos, las cabezas de cada embrión deben mantenerse separadas para el cultivo.
6. Usando pinzas en ángulo, coloque la cabeza de lado mirando hacia la izquierda.
7. Perfore el ojo con un borde de los fórceps, sujetando firmemente la barbilla con el otro.
8. Comenzando en la nuca, rasgue suavemente la piel del cuero cabelludo a lo largo de la línea media hacia la punta del hocico.
9. Al entrar a través de la médula espinal, notable como un óvalo blanco, use los fórceps en ángulo para abrir el cráneo a lo largo de la línea media, exponiendo el cerebro.
10. Despegue suavemente el cráneo del lado hacia arriba, exponiendo el cerebro.
11. Levante el cerebro fuera del cráneo, desechando el cráneo una vez que el cerebro se haya eliminado por completo.
12. Usando los fórceps, retire las meninges, que se notan como una membrana delgada con vasos sanguíneos densos.
13. Coloque los cerebros en una joya (consulte la Tabla de materiales) que contenga 2 ml de HBSS-/- en hielo.
14. Repita los pasos 2.6 a 2.13 con los cerebros restantes, sumando hasta cuatro cerebros por bisutería.
15. Agregue 250 μL de tripsina 10x a la bisutería y triture los cerebros agitando la bisutería. Incubar durante 15 min a 37 °C.
    NOTA: Todos los pasos a partir de este punto en adelante deben realizarse en una campana de cultivo de tejido estéril.
16. Descongele 2 ml de inhibidor de la tripsina de soja (SD) (Leibovitz L-15, 0,52 mg/ml inhibidor de tripsina de soja, 40 μg/ml DNasa I, 3 mg/ml de albúmina sérica bovina [BSA] fracción V; ver Tabla de materiales) de -20 °C colocándola a 37 °C.
17. Agregue 2 ml de inhibidor SD a cada bisutería que contenga cerebros (por bisutería que contenga hasta cuatro cerebros), agitando la bisutería nuevamente para dispersarla uniformemente.
    NOTA: El inhibidor de SD disminuye la actividad de la tripsina para evitar la digestión innecesaria de las muestras y preservar la viabilidad celular.
18. Sin centrifugación, retire 2 ml del sobrenadante de cada bisutería y transfiéralo a un tubo de centrífuga de 15 ml, teniendo cuidado de no transferir grupos celulares.
19. Triturar las células restantes en la bisutería con una aguja de 19 G conectada a una jeringa de 5 ml aspirando la suspensión dos veces. Esto creará una mezcla espesa similar al moco.
    1. Repita dos veces más con una aguja de 21 G. Si quedan grumos, triturar una vez más con la aguja de 21 G.
20. Transfiera las células de la bisutería al mismo tubo centrífugo de 15 ml (a partir del paso 2.18) utilizando una aguja de 23 G.
21. Centrifugar a 200 x g a temperatura ambiente (RT) durante 5 min.
22. Retirar todo el sobrenadante con una pipeta serológica de 5 ml y transferirlo a otro tubo de centrífuga de 15 ml, teniendo cuidado de no alterar el pellet suelto en el fondo que contiene las células requeridas.
23. Centrifugar de nuevo el sobrenadante a 200 x g a RT durante 5 min.
    NOTA: Este paso no es esencial, pero si uno requiere muchas células o tiene pocos embriones, se podría realizar este paso para recuperar tantas células como sea posible del sobrenadante.
24. Usando 10 ml de medios de recubrimiento (PM) (49% de medio de águila modificado de Dulbecco [DMEM], 1% de penicilina/estreptomicina [Pen/Strep], 25% de suero de caballo, 25% de HBSS con Ca 2+ y Mg² + [HBSS⁺ /+]; ver Tabla de materiales), combine y resuspenda los dos gránulos juntos para crear una suspensión de células completas.
25. Contar las células usando azul de tripano y un hemocitómetro o contador celular digital, y diluir la suspensión celular con PM a una concentración de 1.8 x 10⁶ células/ml.

3. Recubrimiento de las células

1. Agregue el volumen requerido de la suspensión celular al formato requerido como se detalla en la Tabla 1: 1,000 μL por pocillo en formato de 6 pocillos, 50 μL por pocillo en formato de 96 pocillos o 100 μL por cubreobjetos.
2. Incubar durante 2-4 h a 37 °C con 5%-7% de_CO2. Verifique que las células se hayan adherido con un microscopio invertido.
3. Retire el medio y rellene con un nuevo medio de diferenciación (DM+: DM- incluyendo insulina de 10 μg/ml. DM-: DMEM, 1% Pen/Strep, 50 nM hidrocortisona, 10 ng/mL de biotina, 2.5 mL 100x N1 suplemento de medios; véase la Tabla de materiales). Los volúmenes se detallan en la Tabla 1. Presione cualquier cubreobjetos flotantes con una punta de pipeta estéril.

4. Mantener las culturas

NOTA: Estos cultivos requieren alimentación tres veces por semana para apoyar el crecimiento y la diferenciación óptimos. Los cultivos alcanzarán una salud y madurez óptimas para experimentos en DIV (días in vitro) 21. Las células se pueden mantener en cultivo hasta por 28 días, después de lo cual los cultivos degeneran rápidamente.

1. Tres veces por semana hasta DIV12, sustituir parte del sobrenadante por DM+ fresca eliminando 500 μL por pocillo en formato de 6 pocillos, 50 μL por pocillo en formato de 96 pocillos o 500 μL por plato que contenga tres cubreobjetos, y añadiendo 600 μL por pocillo en formato de 6 pocillos, 60 μL por pocillo en formato de 96 pocillos, o 600 μL por plato de cubreobjetos (Tabla 1).
2. Tres veces por semana a partir de la DIV13, sustituir parte del sobrenadante por DM- fresca eliminando 500 μL por pocillo en formato de 6 pocillos, 50 μL por pocillo en formato de 96 pocillos o 500 μL por plato que contenga tres cubreobjetos, y añadiendo 600 μL por pocillo en formato de 6 pocillos, 60 μL por pocillo en formato de 96 pocillos, o 600 μL por plato de cubreobjetos (Tabla 1).

Resultados

Microscopia
Los cultivos cultivados en cubreobjetos de vidrio son ideales para analizar por microscopía. Para visualizar el desarrollo de los cultivos, los cubreobjetos se fijaron en paraformaldehído al 4% (PFA) en múltiples puntos de tiempo desde DIV0 (una vez que las células se unieron) hasta DIV28. Los cultivos se tiñeron para imágenes de inmunofluorescencia como se describió anteriormente⁵ utilizando tres combinaciones de tinción diferentes: NG2 (oligodendrocitos in...

Discusión

El SNC es una red compleja que se extiende desde el cerebro hasta la médula espinal y consta de muchos tipos de células, predominantemente neuronas, oligodendrocitos, astrocitos y microglía¹. Como cada célula tiene un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis y la generación de respuestas apropiadas a los desafíos en el SNC 9,10,11^, un sistema de cultivo que contenga todos estos tipos de células es una herra...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Trypsin	Sigma	T4549-100ML	To digest tissue
140 mm TC Dish	Fisher	11339283	Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish
15 mL Falcon	Sarstedt	62554502	To collect cells into pellet for resuspension in plating media
18 G needle	Henke Sass Wolf	4710012040	For trituration of sample
21 G needle	BD	304432	For trituration of sample
23 G needle	Henke Sass Wolf	4710006030	For trituration of sample
35 mm TC Dish	Corning	430165	Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish
5 mL syringe	Fisher	15869152	For trituration of sample
6 well plate	Corning	3516	To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry
7 mL Bijoux	Fisher	DIS080010R	To put brains intp
96 well plate	Corning	3596	To plate out cells for high-throughput testing
ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE	Miltenyi	130-123-284	For flow cytometry staining of astrocytes
Angled forceps	Dumont	0108-5/45-PO	For dissection
Biotin	Sigma	B4501	For DM+/-
Boric Acid	Sigma	B6768-500G	For boric acid buffer
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69	Biolegend	101825	For flow cytometry staining of neurons and astrocytes
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11	Biolegend	103139	For flow cytometry staining of microglia
Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70	Biolegend	101243	For flow cytometry staining of microglia
BSA Fraction V	Sigma	A3059-10G	For SD Inhibitor
CNP	Abcam	AB6319	Mature oligodendrocytes
Coverslip	VWR	631-0149	To plate out cells for microscopy
Dissection Scissors	Sigma	S3146-1EA	For dissection
DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine	Gibco	21969-035	For DM+/-, and for plating media
DNase I	Thermofisher	18047019	For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma
DNase I	Sigma	D4263	For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780	Thermofisher	65-0865-14	Live / Dead stain
Fine forceps	Dumont	0102-SS135-PO	For dissection
GFAP	Invitrogen	13-0300	Astrocytes
HBSS w Ca Mg	Sigma	H9269-500ML	For plating media
HBSS w/o Ca Mg	Sigma	H9394-500ML	For brains to be added to
Horse Serum	Gibco	26050-070	For plating media
Hydrocortisone	Sigma	H0396	For DM+/-
Iba1	Alpha-Laboratories	019-1971	Microglia
Insulin	Sigma	I1882	For DM+
Leibovitz L-15	GIbco	11415-049	For SD Inhibitor
MBP	Bio-Rad	MCA409S	Myelin
Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit	BioTechne	DY478-05	ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate
N1 media supplement	Sigma	N6530-5ML	For DM+/-
Nestin	Merck	MAB353	Neuronal stem/progenitor cells
NeuN	Thermofisher	PA578499	Neuronal cell body
NG2	Sigma	AB5320	Immature oligodendrocytes
O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC	Miltenyi	130-119-155	For flow cytometry staining of oligodendrocytes
Pen/Strep	Sigma	P0781-100ML	For DM+/-, and for plating media
Poly-L-Lysinehydrobromide	Sigma	P1274	For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips
SMI31	BioLegend	801601	Axons
Sodium Tetraborate	Sigma	221732-100G	For boric acid buffer
Trizol	Thermofisher	15596026	For lysing cells for RT-qPCR
Trypsin inhibitor from soybean	Sigma	T9003-100MG	For SD Inhibitor