Establecimiento de cultivos mixtos de células neuronales y gliales a partir de cerebros embrionarios de ratones para estudiar la infección y la inmunidad innata

Resumen

Este protocolo presenta una forma única de generar cultivos celulares del sistema nervioso central a partir de cerebros embrionarios de ratón del día 17 para la investigación neuro(inmuno)lógica. Este modelo se puede analizar utilizando varias técnicas experimentales, incluyendo RT-qPCR, microscopía, ELISA y citometría de flujo.

Resumen

Los modelos del sistema nervioso central (SNC) deben recapitular la compleja red de células interconectadas que se encuentran in vivo. El SNC consiste principalmente en neuronas, astrocitos, oligodendrocitos y microglía. Debido a los crecientes esfuerzos para reemplazar y reducir el uso de animales, se han desarrollado una variedad de sistemas de cultivo celular in vitro para explorar las propiedades celulares innatas, que permiten el desarrollo de terapias para infecciones y patologías del SNC. Si bien ciertas preguntas de investigación pueden ser abordadas por sistemas de cultivo celular basados en humanos, como las células madre pluripotentes (inducidas), trabajar con células humanas tiene sus propias limitaciones con respecto a la disponibilidad, los costos y la ética. Aquí, describimos un protocolo único para aislar y cultivar células de cerebros embrionarios de ratones. Los cultivos celulares neuronales mixtos resultantes imitan varias poblaciones celulares e interacciones que se encuentran en el cerebro in vivo. En comparación con los métodos equivalentes actuales, este protocolo imita más de cerca las características del cerebro y también obtiene más células, lo que permite investigar más condiciones experimentales de un ratón preñado. Además, el protocolo es relativamente fácil y altamente reproducible. Estos cultivos se han optimizado para su uso en varias escalas, incluidas las pantallas de alto rendimiento basadas en 96 pocillos, el análisis de microscopía de 24 pocillos y los cultivos de 6 pocillos para citometría de flujo y análisis de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR). Este método de cultivo es una herramienta poderosa para investigar la infección y la inmunidad dentro del contexto de algunas de las complejidades del SNC con la conveniencia de los métodos in vitro .

Introducción

Mejorar nuestra comprensión del sistema nervioso central (SNC) es fundamental para mejorar las opciones terapéuticas para muchas enfermedades neuroinflamatorias y neurodegenerativas. El SNC, una compleja red de células interconectadas dentro del cerebro, la médula espinal y los nervios ópticos, comprende neuronas, oligodendrocitos, astrocitos y sus células inmunes innatas, la microglía¹. Un enfoque in vitro a menudo puede reducir drásticamente el número de ratones necesarios para realizar una investigación significativa; sin embargo, la naturaleza compleja del SNC hace imposible recapitular la situación in vivo utilizando líne....

Protocolo

Todos los experimentos con animales cumplieron con las leyes y pautas locales para el uso de animales, y fueron aprobados por el Comité de Revisión Ética local de la Universidad de Glasgow. Los animales fueron alojados en condiciones específicas libres de patógenos de acuerdo con la Ley de Procedimientos Científicos de Animales del Reino Unido de 1986, bajo los auspicios de una Licencia de Proyecto del Ministerio del Interior del Reino Unido. Para este estudio, se utilizaron ratones adultos C57BL / 6J criados internamente. Se recomienda el uso de mujeres jóvenes (8-12 semanas) debido a la mayor tasa de éxito del embarazo; Los machos pueden ser reutilizados para múltip....

Resultados

Microscopia
Los cultivos cultivados en cubreobjetos de vidrio son ideales para analizar por microscopía. Para visualizar el desarrollo de los cultivos, los cubreobjetos se fijaron en paraformaldehído al 4% (PFA) en múltiples puntos de tiempo desde DIV0 (una vez que las células se unieron) hasta DIV28. Los cultivos se tiñeron para imágenes de inmunofluorescencia como se describió anteriormente⁵ utilizando tres combinaciones de tinción diferentes: NG2 (oligodendrocitos in.......

Discusión

El SNC es una red compleja que se extiende desde el cerebro hasta la médula espinal y consta de muchos tipos de células, predominantemente neuronas, oligodendrocitos, astrocitos y microglía¹. Como cada célula tiene un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis y la generación de respuestas apropiadas a los desafíos en el SNC 9,10,11^, un sistema de cultivo que contenga todos estos tipos de células es una herra.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Trypsin	Sigma	T4549-100ML	To digest tissue
140 mm TC Dish	Fisher	11339283	Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish
15 mL Falcon	Sarstedt	62554502	To collect cells into pellet for resuspension in plating media
18 G needle	Henke Sass Wolf	4710012040	For trituration of sample
21 G needle	BD	304432	For trituration of sample
23 G needle	Henke Sass Wolf	4710006030	For trituration of sample
35 mm TC Dish	Corning	430165	Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish
5 mL syringe	Fisher	15869152	For trituration of sample
6 well plate	Corning	3516	To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry
7 mL Bijoux	Fisher	DIS080010R	To put brains intp
96 well plate	Corning	3596	To plate out cells for high-throughput testing
ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE	Miltenyi	130-123-284	For flow cytometry staining of astrocytes
Angled forceps	Dumont	0108-5/45-PO	For dissection
Biotin	Sigma	B4501	For DM+/-
Boric Acid	Sigma	B6768-500G	For boric acid buffer
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69	Biolegend	101825	For flow cytometry staining of neurons and astrocytes
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11	Biolegend	103139	For flow cytometry staining of microglia
Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70	Biolegend	101243	For flow cytometry staining of microglia
BSA Fraction V	Sigma	A3059-10G	For SD Inhibitor
CNP	Abcam	AB6319	Mature oligodendrocytes
Coverslip	VWR	631-0149	To plate out cells for microscopy
Dissection Scissors	Sigma	S3146-1EA	For dissection
DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine	Gibco	21969-035	For DM+/-, and for plating media
DNase I	Thermofisher	18047019	For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma
DNase I	Sigma	D4263	For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780	Thermofisher	65-0865-14	Live / Dead stain
Fine forceps	Dumont	0102-SS135-PO	For dissection
GFAP	Invitrogen	13-0300	Astrocytes
HBSS w Ca Mg	Sigma	H9269-500ML	For plating media
HBSS w/o Ca Mg	Sigma	H9394-500ML	For brains to be added to
Horse Serum	Gibco	26050-070	For plating media
Hydrocortisone	Sigma	H0396	For DM+/-
Iba1	Alpha-Laboratories	019-1971	Microglia
Insulin	Sigma	I1882	For DM+
Leibovitz L-15	GIbco	11415-049	For SD Inhibitor
MBP	Bio-Rad	MCA409S	Myelin
Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit	BioTechne	DY478-05	ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate
N1 media supplement	Sigma	N6530-5ML	For DM+/-
Nestin	Merck	MAB353	Neuronal stem/progenitor cells
NeuN	Thermofisher	PA578499	Neuronal cell body
NG2	Sigma	AB5320	Immature oligodendrocytes
O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC	Miltenyi	130-119-155	For flow cytometry staining of oligodendrocytes
Pen/Strep	Sigma	P0781-100ML	For DM+/-, and for plating media
Poly-L-Lysinehydrobromide	Sigma	P1274	For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips
SMI31	BioLegend	801601	Axons
Sodium Tetraborate	Sigma	221732-100G	For boric acid buffer
Trizol	Thermofisher	15596026	For lysing cells for RT-qPCR
Trypsin inhibitor from soybean	Sigma	T9003-100MG	For SD Inhibitor