用于测定单细胞材料特性的剪切测定方案

Summary

该协议概述了 体外癌性和非癌性细胞系的机械特性的定量。癌细胞和正常细胞力学的保守差异可以作为生物标志物，可能对预后和诊断产生影响。

Abstract

不规则生物力学是癌症生物学的标志，需要广泛研究。电池的机械性能与材料的机械性能相似。细胞对压力和应变的抵抗力、弛豫时间和弹性都是可以得出并与其他类型的细胞进行比较的特性。量化癌细胞（恶性）与正常（非恶性）细胞的机械特性使研究人员能够进一步揭示这种疾病的生物物理基础。虽然已知癌细胞的机械性能始终与正常细胞的机械性能不同，但缺乏从培养细胞中推断出这些特性的标准实验程序。

本文概述了使用流体剪切测定法在 体外量化 单细胞机械性能的程序。该测定背后的原理涉及将流体剪切应力施加到单个细胞上，并随着时间的推移光学监测由此产生的细胞变形。随后使用数字图像相关（DIC）分析表征细胞机械性能，并将适当的粘弹性模型拟合到DIC分析生成的实验数据中。总体而言，此处概述的方案旨在为诊断难以治疗的癌症提供更有效和有针对性的方法。

Introduction

研究癌细胞和非癌细胞之间的生物物理差异提供了新的诊断和治疗机会¹。了解生物力学/机械生物学的差异如何影响肿瘤进展和治疗耐药性，将揭示靶向治疗和早期诊断的新途径²。

虽然已知癌细胞的机械性能与正常细胞不同（例如，质膜和核包膜的粘弹性）^3,4,5，但缺乏在活细胞中测量这些特性的稳健且可重复的方法^6。剪切测定方法用于量化细胞的机械性能，方法是使单个细胞承受流体剪切应力并分析其个体响应和对施加应力的抵抗力3,4,5,7,8,9。尽管已经使用了几种方法和技术来表征单个细胞的机械性能，但这些方法和技术往往会通过以下方式影响细胞材料性能：i）由于压痕深度，复杂的尖端几何形状....

Protocol

1. 单细胞剪切测定的准备

1. 细胞培养
   1. 在含有 2 mL 培养基的 35 mm x 10 mm 培养皿中接种约 50,000 个悬浮单细胞。
      注意：在接种前涡旋悬浮细胞以分解细胞聚集体。
   2. 将细胞在37°C孵育，并允许10至48小时用于细胞附着和完整的细胞骨架蛋白形成。
      注意：考虑细胞附着的持续时间，以及增殖和生长速率，以确保足够的细胞生长和附着，同时避免细胞聚集。这些参数因细胞类型而异。

2. 剪切测定实验

1. 剪切测定粘性流动介质的制备
   1. 为确保略微粘稠的流动培养基（0.015-0.02 Pa·s），测量并向培养基中加入0.05 wt%的无毒无过敏性甲基纤维素（4 Pa·s）。
   2. 为确保混合均匀，用磁力搅拌器/热板在~60-70°C的温度下预热基础培养基~10-20分钟。在不断搅拌介质的同时，轻轻加入甲基纤维素，使其快速分散，以避免甲基纤维素颗粒凝结。让此过程持续~15-24小时，以确保培养基+纤维素的澄清溶液。
      注意：避免溶液过热。
   3. 要测量流动介质的粘度，请使用流变仪测试 ~0.5-1 mL 的代表性流动介质。从读数中，确定流体粘度并利用该值表示剪切流体介质的粘度（μ），以使用公式（2

Discussion

剪切测定方法，包括建立一个伪机械生物学环境来模拟细胞与周围机械微环境的相互作用及其对机械应力的反应，已经产生了细胞力学性能目录，其模式显示了癌细胞系中保守的物理异型性^3,4,5,7,8.该方法结合了对基本流体力学和物理学的理解，以表征细胞的独特机械性能，?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CELL CULTURE
.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x[-] sodium bicarbonate	Corning	25-053-ci	For cellular detachment from substrate in cell culture
15 mL centrifuge tubes	Falcon by Corning	05-527-90
35 mm Petri dishes	Corning	430165
50 mL centrifuge tubes	Falcon by Corning	14-432-22
centrifuge	any		For sterile cell culture
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) 1x	Corning	10-013-cv	Or any other media for culturing cells. DMEM was used for culturing U87 cells
gloves	any		For sterile cell culture
Heracell Vios 160i CO2 Incubator	Thermo Scientific	51033770	For Incubation during cell culture
Hood	any		For sterile cell culture
micropipette	any		For sterile cell culture
micropipette tips	any		For sterile cell culture
Microscope	Leica/any		For sterile cell culture
Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium PBS, 1x	Corning	21-040-CM
pipetman	any		For sterile cell culture
pipette tips	any		For sterile cell culture
Precision GP 10 liquid incubator	Thermo Scientific	TSGP02
T25 flask	Corning	430639
T75 flask	Corning	430641U
SHEAR ASSAY
100 mL beaker	any		For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media
DMEM	Corning
Flow chamber + rubber gasket	Glycotech	31-001	Circular Flow chamber Kit ( for 35 mm tissue culture dishes)
Hybrid Rheometer	HR-2 Discovery Hybrid Rheometer		For determination of shear fluid viscosity
magnetic stir bar	any		For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media
magnetic stir plate	any		For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media
methyl cellulose	any		To increase viscosity of DMEM in flow media
Syringe Pump	KD Scientific Geminin 88 plus	788088	For programming fluid infusion and withdrawal
syringes, tubing, and connectors			For shear apparatus setup
SOFTWARE
ABAQUS software	Simulia
Digitial Image Correlation software	LaVision, Germany	DAVIS 10.1.2
Imaging software	Leica/any microscope software
MATLAB	MATLAB	MATLAB_R2020B