פרוטוקול בדיקת גזירה לקביעת תכונות חומר חד-תאי

Summary

פרוטוקול זה מתאר את כימות התכונות המכניות של קווי תאים סרטניים ולא סרטניים במבחנה. הבדלים שמורים במכניקה של תאים סרטניים ונורמליים יכולים לשמש כסמן ביולוגי שעשוי להיות בעל השלכות על הפרוגנוזה והאבחנה.

Abstract

ביומכניקה לא סדירה היא סימן ההיכר של ביולוגיה של סרטן הנתונה למחקר מקיף. התכונות המכניות של תא דומות לאלה של חומר. עמידותו של התא בפני לחץ ומתח, זמן ההרפיה שלו וגמישותו הם כולם תכונות שניתן להפיק ולהשוות לסוגים אחרים של תאים. כימות התכונות המכניות של תאים סרטניים (ממאירים) לעומת תאים נורמליים (לא ממאירים) מאפשר לחוקרים להמשיך ולחשוף את היסודות הביופיזיקליים של מחלה זו. בעוד התכונות המכניות של תאים סרטניים ידועות כשונות באופן עקבי מהתכונות המכניות של תאים נורמליים, הליך ניסיוני סטנדרטי כדי להסיק תכונות אלה מתאים בתרבית לוקה בחסר.

מאמר זה מתאר הליך לכימות התכונות המכניות של תאים בודדים במבחנה באמצעות בדיקת גזירה נוזלית. העיקרון מאחורי בדיקה זו כרוך בהפעלת לחץ גזירה נוזלי על תא בודד וניטור אופטי של העיוות התאי שנוצר לאורך זמן. תכונות מכניות של תאים מאופיינות לאחר מכן באמצעות ניתוח מתאם תמונה דיגיטלית (DIC) והתאמת מודל ויסקו-אלסטי מתאים לנתונים הניסיוניים המופקים מניתוח DIC. בסך הכל, הפרוטוקול המתואר כאן נועד לספק שיטה יעילה וממוקדת יותר לאבחון של סוגי סרטן קשים לטיפול.

Introduction

חקר ההבדלים הביופיזיים בין תאים סרטניים ולא-סרטניים מאפשר הזדמנויות אבחוניות וטיפוליות חדשות¹. הבנת האופן שבו הבדלים בביומכניקה/מכנוביולוגיה תורמים להתקדמות הגידול ולעמידות לטיפול תחשוף דרכים חדשות לטיפול ממוקד ואבחון מוקדם².

בעוד שידוע כי תכונות מכניות של תאים סרטניים שונות מתאים נורמליים (למשל, צמיגות קרום הפלזמה והמעטפת הגרעינית)^3,4,5, חסרות שיטות חזקות וניתנות לשחזור למדידת תכונות אלה בתאים חיים⁶. שיטת בדיקת הגזירה משמשת לכימות התכונות המכניות של תאים על ידי חשיפת תאים בודד....

Protocol

1. הכנה לבדיקת הגזירה החד-תאית

1. תרבית תאים
   1. זרעו כ-50,000 תאים בודדים מרחפים בצלוחית פטרי בגודל 35 מ"מ על 10 מ"מ המכילה 2 מ"ל של תרבית.
      הערה: מערבל את התאים המרחפים לפני הזריעה כדי לפרק את צברי התאים.
   2. לדגור על התאים ב 37 ° C ולאפשר בין 10 ל 48 שעות עבור חיבור תאים והיווצרות מלאה של .......

Discussion

שיטת בדיקת הגזירה, הכוללת הקמת סביבה פסאודו-מכנוביולוגית המדמה את האינטראקציה של תאים עם המיקרו-סביבה המכנית הסובבת אותם ואת תגובותיהם לעקות מכניות, יצרה קטלוג של תכונות מכניות תאיות, שדפוסיהן מראים אטיפיה פיזית שמורה בין שורות תאים סרטניים 3,4,5,7,8

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CELL CULTURE
.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x[-] sodium bicarbonate	Corning	25-053-ci	For cellular detachment from substrate in cell culture
15 mL centrifuge tubes	Falcon by Corning	05-527-90
35 mm Petri dishes	Corning	430165
50 mL centrifuge tubes	Falcon by Corning	14-432-22
centrifuge	any		For sterile cell culture
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) 1x	Corning	10-013-cv	Or any other media for culturing cells. DMEM was used for culturing U87 cells
gloves	any		For sterile cell culture
Heracell Vios 160i CO2 Incubator	Thermo Scientific	51033770	For Incubation during cell culture
Hood	any		For sterile cell culture
micropipette	any		For sterile cell culture
micropipette tips	any		For sterile cell culture
Microscope	Leica/any		For sterile cell culture
Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium PBS, 1x	Corning	21-040-CM
pipetman	any		For sterile cell culture
pipette tips	any		For sterile cell culture
Precision GP 10 liquid incubator	Thermo Scientific	TSGP02
T25 flask	Corning	430639
T75 flask	Corning	430641U
SHEAR ASSAY
100 mL beaker	any		For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media
DMEM	Corning
Flow chamber + rubber gasket	Glycotech	31-001	Circular Flow chamber Kit ( for 35 mm tissue culture dishes)
Hybrid Rheometer	HR-2 Discovery Hybrid Rheometer		For determination of shear fluid viscosity
magnetic stir bar	any		For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media
magnetic stir plate	any		For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media
methyl cellulose	any		To increase viscosity of DMEM in flow media
Syringe Pump	KD Scientific Geminin 88 plus	788088	For programming fluid infusion and withdrawal
syringes, tubing, and connectors			For shear apparatus setup
SOFTWARE
ABAQUS software	Simulia
Digitial Image Correlation software	LaVision, Germany	DAVIS 10.1.2
Imaging software	Leica/any microscope software
MATLAB	MATLAB	MATLAB_R2020B