Protocolo de ensaio de cisalhamento para a determinação de propriedades de material de célula única

Summary

Este protocolo descreve a quantificação das propriedades mecânicas de linhagens celulares cancerosas e não cancerosas in vitro. Diferenças conservadas na mecânica de células cancerosas e normais podem atuar como um biomarcador que pode ter implicações no prognóstico e diagnóstico.

Abstract

A biomecânica irregular é uma marca da biologia do câncer sujeita a extenso estudo. As propriedades mecânicas de uma célula são semelhantes às de um material. A resistência de uma célula ao estresse e à tensão, seu tempo de relaxamento e sua elasticidade são propriedades que podem ser derivadas e comparadas a outros tipos de células. Quantificar as propriedades mecânicas de células cancerosas (malignas) versus normais (não malignas) permite que os pesquisadores descubram ainda mais os fundamentos biofísicos desta doença. Embora as propriedades mecânicas das células cancerosas sejam conhecidas por diferir consistentemente das propriedades mecânicas das células normais, um procedimento experimental padrão para deduzir essas propriedades das células em cultura está faltando.

Este trabalho descreve um procedimento para quantificar as propriedades mecânicas de células isoladas in vitro usando um ensaio de cisalhamento fluido. O princípio por trás deste ensaio envolve a aplicação de tensão de cisalhamento de fluido em uma única célula e o monitoramento óptico da deformação celular resultante ao longo do tempo. As propriedades mecânicas celulares são posteriormente caracterizadas usando a análise de correlação digital de imagem (DIC) e ajustando um modelo viscoelástico apropriado aos dados experimentais gerados a partir da análise DIC. De modo geral, o protocolo aqui delineado visa fornecer um método mais eficaz e direcionado para o diagnóstico de cânceres de difícil tratamento.

Introduction

O estudo das diferenças biofísicas entre células cancerosas e não cancerosas permite novas oportunidades diagnósticas e terapêuticas¹. A compreensão de como as diferenças na biomecânica/mecanobiologia contribuem para a progressão tumoral e resistência ao tratamento revelará novos caminhos para a terapia-alvo e o diagnóstico precoce².

Embora se saiba que as propriedades mecânicas das células cancerosas diferem das células normais (por exemplo, viscoelasticidade da membrana plasmática e do envelope nuclear)^3,4,5, faltam métod....

Protocol

1. Preparação para o ensaio de cisalhamento unicelular

1. Cultura celular
   1. Semeando aproximadamente 50.000 células isoladas suspensas em uma placa de Petri de 35 mm x 10 mm contendo 2 mL de meio de cultura.
      NOTA: Vórtice as células suspensas antes da semeadura para quebrar os agregados celulares.
   2. Incubar as células a 37 °C e permitir entre 10 a 48 h para a ligação celular e formação completa de proteínas do citoesqueleto.
      NOTA: Considere a duração da ligação .......

Discussion

O método de ensaio de cisalhamento, que inclui a criação de um ambiente pseudomecanobiológico para simular a interação das células com o microambiente mecânico circundante e suas respostas a estresses mecânicos, produziu um catálogo de propriedades mecânicas celulares, cujos padrões mostram atipias físicas conservadas entre linhagens de células cancerosas3,4,5,7,8

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CELL CULTURE
.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x[-] sodium bicarbonate	Corning	25-053-ci	For cellular detachment from substrate in cell culture
15 mL centrifuge tubes	Falcon by Corning	05-527-90
35 mm Petri dishes	Corning	430165
50 mL centrifuge tubes	Falcon by Corning	14-432-22
centrifuge	any		For sterile cell culture
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) 1x	Corning	10-013-cv	Or any other media for culturing cells. DMEM was used for culturing U87 cells
gloves	any		For sterile cell culture
Heracell Vios 160i CO2 Incubator	Thermo Scientific	51033770	For Incubation during cell culture
Hood	any		For sterile cell culture
micropipette	any		For sterile cell culture
micropipette tips	any		For sterile cell culture
Microscope	Leica/any		For sterile cell culture
Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium PBS, 1x	Corning	21-040-CM
pipetman	any		For sterile cell culture
pipette tips	any		For sterile cell culture
Precision GP 10 liquid incubator	Thermo Scientific	TSGP02
T25 flask	Corning	430639
T75 flask	Corning	430641U
SHEAR ASSAY
100 mL beaker	any		For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media
DMEM	Corning
Flow chamber + rubber gasket	Glycotech	31-001	Circular Flow chamber Kit ( for 35 mm tissue culture dishes)
Hybrid Rheometer	HR-2 Discovery Hybrid Rheometer		For determination of shear fluid viscosity
magnetic stir bar	any		For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media
magnetic stir plate	any		For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media
methyl cellulose	any		To increase viscosity of DMEM in flow media
Syringe Pump	KD Scientific Geminin 88 plus	788088	For programming fluid infusion and withdrawal
syringes, tubing, and connectors			For shear apparatus setup
SOFTWARE
ABAQUS software	Simulia
Digitial Image Correlation software	LaVision, Germany	DAVIS 10.1.2
Imaging software	Leica/any microscope software
MATLAB	MATLAB	MATLAB_R2020B