איתור מיטופגיה בתאי Caenorhabditis elegans ובתאי יונקים באמצעות צבעים ספציפיים לאברונים

Summary

חקר מיטופגיה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, חיישנים גנטיים ואימונופלואורסנציה דורש ציוד יקר, כוח אדם מיומן והשקעת זמן משמעותית. כאן, אנו מדגימים את היעילות של ערכת צבע פלואורסצנטית מסחרית בכימות תהליך המיטופגיה הן ב- Caenorhabditis elegans והן בקו תאים לסרטן הכבד.

Abstract

מיטוכונדריה חיוניים לתפקודים ביולוגיים שונים, כולל ייצור אנרגיה, מטבוליזם של שומנים, הומאוסטזיס סידן, ביוסינתזה של הם, מוות תאי מווסת ויצירת מיני חמצן תגובתי (ROS). ROS חיוניים לתהליכים ביולוגיים מרכזיים. עם זאת, כאשר הם אינם מבוקרים, הם עלולים להוביל לפגיעה חמצונית, כולל נזק למיטוכונדריה. מיטוכונדריה פגועים משחררים יותר ROS, ובכך מגבירים את הפגיעה התאית ואת מצב המחלה. תהליך הומיאוסטטי בשם אוטופגיה מיטוכונדריאלית (מיטופגיה) מסיר באופן סלקטיבי מיטוכונדריה פגומים, אשר מוחלפים בחדשים. ישנם מסלולי מיטופגיה מרובים, כאשר נקודת הקצה הנפוצה היא פירוק המיטוכונדריה הפגועה בליזוזומים.

מספר מתודולוגיות, כולל חיישנים גנטיים, אימונופלואורסנציה של נוגדנים ומיקרוסקופ אלקטרונים, משתמשות בנקודת קצה זו כדי לכמת מיטופגיה. לכל שיטה לבדיקת מיטופגיה יתרונות משלה, כגון מיקוד רקמות/תאים ספציפיים (עם חיישנים גנטיים) ופירוט רב (במיקרוסקופ אלקטרונים). עם זאת, שיטות אלה דורשות לעתים קרובות משאבים יקרים, כוח אדם מיומן, וזמן הכנה ארוך לפני הניסוי עצמו, כגון ליצירת בעלי חיים טרנסגניים. כאן, אנו מציגים חלופה חסכונית למדידת מיטופגיה באמצעות צבעים פלואורסצנטיים הזמינים מסחרית המכוונים למיטוכונדריה וליזוזומים. שיטה זו מודדת ביעילות מיטופגיה בנמטודה Caenorhabditis elegans ובתאי כבד אנושיים, מה שמצביע על יעילותה הפוטנציאלית במערכות מודל אחרות.

Introduction

מיטוכונדריה חיוניים לכל בעלי החיים האירוביים, כולל בני אדם. הם ממירים את האנרגיה הכימית של ביומולקולות לאדנוזין טריפוספט (ATP) באמצעות זרחן חמצוני¹, מסנתזים הם², מפרקים חומצות שומן באמצעות חמצון β³, מווסתים הומאוסטזיס סידן⁴ וברזל⁵, שולטים במוות תאי על ידי אפופטוזיס⁶, ומייצרים מיני חמצן תגובתי (ROS), הממלאים תפקיד חיוני בהומאוסטזיס חיזור⁷. שני תהליכים משלימים ומנוגדים שומרים על שלמות ותפקוד תקין של המיטוכונדריה: סינתזה של רכיבים מיטוכונדריאליים חדשים (ביוגנזה) והסרה סלקטיבית של רכיבים פגומים באמ....

Protocol

הערה: לנוחיות הקוראים, חילקנו את הפרוטוקול לשני חלקים: האחד מתמקד בפרוטוקול למדידת מיטופגיה ב- C. elegans, והשני מתמקד בפרוטוקול למדידת מיטופגיה בתאי כבד. את רשימת החומרים ניתן למצוא בטבלת החומרים המצורפת.

1. פרוטוקול C. elegans

1. הכנת לוחות גידול נמטו?.......

Discussion

מסלולי מיטופגיה מרובים מערבים חלבונים וביומולקולות שונות (למשל, קרדיוליפין²⁹). עם זאת, נקודת הקצה של מסלולים אלה דומה - פירוק מיטוכונדריה על ידי אנזימים ליזוזומליים^12,13. ואכן, מספר שיטות משתמשות בנקודת קצה זו כדי לכמת מיטופגיה. עם זאת, שיטות מסוימ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent or resource
Analytical balance	Mettler-Toledo
Bacto Agar	BD-Difco	214010
Bacto Peptone	BD-Difco	211677
Bacto Tryptone	BD-Difco	211705
Bacto Yeast extract	BD-Difco	212750
Calcium chloride	Sigma	C1016
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)	Sigma	C2920
Chemicals
Cholestrol	Thermo Fisher	C/5360/48
DMEM high glucose	Biological Industries	01-055-1A
Double distilled water (DDW)
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Biological Industries	02-023-1A
FBS heat inactivated	Invitrogen	M7514
Gluteradehyde (25%)	Sigma	G5882
HEPES Buffer 1 M	Biological Industries	03-025-1B
L-gluatamine	Biological Industries	03-020-1B
Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter Reagent	Abcam	ab139487
Magnesium Sulfate	Sigma	M7506
Nonidet P 40	Sigma	74385
Paraformalydehyde (16%)	Electron Microscopy Sciences	15720
Poloxamer 188 Solution	Sigma	P5556
Potassium dihydrogen phosphate	Millipore	1.04873.1000
Potassium phosphate dibasic	Sigma	P3786
SeaKem LE Agarose	Lonza	50004
Sodium Chloride	Bio-Lab	1903059100
Sodium Hydroxide	Gadot	1310732
Sodium phosphate dibasic dodecahydrate	Sigma	4273
Tetracycline hydrochloride	Sigma	87128-25G
Trypsin-EDTA	Biological Industries	03-052-1A
VL-850: 1,8-diaminooxy-octane	Patented
Glass/Plastic Disposables
0.22 μm syringe filter	Millex GV	SLGV033RS
1.7 mL Micro Centrifuge Tubes	Lifegene	LMCT1.7B-500
10 cm Petri plates	Corning	430167
1,000 mL Erlenmeyer Flask	IsoLab, Germany
15 mL Sterile Polypropylene tube	Lifegene	LTB15-500
35 mm Petri dishes	Bar Naor	BN9015810
500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μm	Lifegene	LG-FPE205500S
50 mL Sterile Polypropylene tube	Lifegene	LTB50-500
Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mm	Marienfeld	101152
Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glass	Pyrex	99445-13
iBiDi 8 well μ-slides	iBiDi	80826
Microscope cover glass 24 x 40 mm	Bar Naor	BN1052421ECALN
Platinum iridium 0.25 mM wire	World Precision Instruments	PT1002
Instruments
Cell counter CellDrop BF	DeNovix	CellDrop BF-UNLTD
Microspin FV-2400	Biosan	BS-010201-AAA
Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements software	Nikon	CSU-W1
Olympus SZ61 stereo microscope	Olympus	SZ61
pH meter	Mettler-Toledo	MT30019032
Revolver Adjustable Lab Rotator	Labnet	H5600