Detecção de Mitofagia em Caenorhabditis elegans e Células de Mamíferos Usando Corantes Organel-Específicos

Summary

Explorar a mitofagia por meio de microscopia eletrônica, sensores genéticos e imunofluorescência requer equipamentos caros, pessoal qualificado e um investimento de tempo significativo. Aqui, demonstramos a eficácia de um kit comercial de corante de fluorescência na quantificação do processo de mitofagia em ambos Caenorhabditis elegans e uma linhagem celular de câncer de fígado.

Abstract

As mitocôndrias são essenciais para várias funções biológicas, incluindo produção de energia, metabolismo lipídico, homeostase do cálcio, biossíntese do heme, morte celular regulada e geração de espécies reativas de oxigênio (EROs). As ROS são vitais para os principais processos biológicos. No entanto, quando não controladas, podem levar a lesões oxidativas, incluindo danos mitocondriais. As mitocôndrias danificadas liberam mais EROs, intensificando assim a lesão celular e o estado da doença. Um processo homeostático chamado autofagia mitocondrial (mitofagia) remove seletivamente as mitocôndrias danificadas, que são então substituídas por novas. Existem múltiplas vias de mitofagia, com o objetivo comum sendo a quebra das mitocôndrias danificadas nos lisossomos.

Várias metodologias, incluindo sensores genéticos, imunofluorescência de anticorpos e microscopia eletrônica, usam esse desfecho para quantificar a mitofagia. Cada método para examinar a mitofagia tem suas vantagens, como o direcionamento específico de tecido/célula (com sensores genéticos) e grande detalhe (com microscopia eletrônica). No entanto, esses métodos geralmente exigem recursos caros, pessoal treinado e um longo tempo de preparação antes do experimento real, como para a criação de animais transgênicos. Aqui, apresentamos uma alternativa custo-efetiva para medir mitofagia usando corantes fluorescentes comercialmente disponíveis visando mitocôndrias e lisossomos. Este método mede efetivamente a mitofagia no nematoide Caenorhabditis elegans e em células hepáticas humanas, o que indica sua potencial eficiência em outros sistemas modelo.

Introduction

As mitocôndrias são essenciais para todos os animais aeróbicos, incluindo os seres humanos. Eles convertem a energia química das biomoléculas em trifosfato de adenosina (ATP) via fosforilação oxidativa¹, sintetizam heme², degradam ácidos graxos através da oxidação β³, regulam a homeostase do cálcio⁴ e ferro⁵, controlam a morte celular pela apoptose⁶ e geram espécies reativas de oxigênio (EROs), que desempenham um papel vital na homeostase redox7. Dois processos complementares e opostos mantêm a....

Protocol

NOTA: Para maior comodidade dos leitores, dividimos o protocolo em duas partes: uma enfoca o protocolo de medição de mitofagia em C. elegans, e a outra foca o protocolo de medição de mitofagia em células hepáticas. A lista de materiais pode ser encontrada na Tabela de Materiais fornecidos.

1. O protocolo de C. elegans

1. Preparo das placas de meio de cultura do nematoide (NGM) e do estoque bacteriano OP50 de Escherichia coli<.......

Discussion

Múltiplas vias de mitofagia envolvem várias proteínas e biomoléculas (por exemplo, cardiolipina²⁹). Entretanto, o desfecho dessas vias é semelhante, a degradação das mitocôndrias por enzimas lisossômicas^12,13. De fato, vários métodos utilizam esse desfecho para quantificar a mitofagia. No entanto, alguns métodos, como a microscopia eletrônica, exigem acesso a equipamentos caros, especialistas treinados e um tempo de preparaç?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent or resource
Analytical balance	Mettler-Toledo
Bacto Agar	BD-Difco	214010
Bacto Peptone	BD-Difco	211677
Bacto Tryptone	BD-Difco	211705
Bacto Yeast extract	BD-Difco	212750
Calcium chloride	Sigma	C1016
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)	Sigma	C2920
Chemicals
Cholestrol	Thermo Fisher	C/5360/48
DMEM high glucose	Biological Industries	01-055-1A
Double distilled water (DDW)
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Biological Industries	02-023-1A
FBS heat inactivated	Invitrogen	M7514
Gluteradehyde (25%)	Sigma	G5882
HEPES Buffer 1 M	Biological Industries	03-025-1B
L-gluatamine	Biological Industries	03-020-1B
Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter Reagent	Abcam	ab139487
Magnesium Sulfate	Sigma	M7506
Nonidet P 40	Sigma	74385
Paraformalydehyde (16%)	Electron Microscopy Sciences	15720
Poloxamer 188 Solution	Sigma	P5556
Potassium dihydrogen phosphate	Millipore	1.04873.1000
Potassium phosphate dibasic	Sigma	P3786
SeaKem LE Agarose	Lonza	50004
Sodium Chloride	Bio-Lab	1903059100
Sodium Hydroxide	Gadot	1310732
Sodium phosphate dibasic dodecahydrate	Sigma	4273
Tetracycline hydrochloride	Sigma	87128-25G
Trypsin-EDTA	Biological Industries	03-052-1A
VL-850: 1,8-diaminooxy-octane	Patented
Glass/Plastic Disposables
0.22 μm syringe filter	Millex GV	SLGV033RS
1.7 mL Micro Centrifuge Tubes	Lifegene	LMCT1.7B-500
10 cm Petri plates	Corning	430167
1,000 mL Erlenmeyer Flask	IsoLab, Germany
15 mL Sterile Polypropylene tube	Lifegene	LTB15-500
35 mm Petri dishes	Bar Naor	BN9015810
500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μm	Lifegene	LG-FPE205500S
50 mL Sterile Polypropylene tube	Lifegene	LTB50-500
Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mm	Marienfeld	101152
Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glass	Pyrex	99445-13
iBiDi 8 well μ-slides	iBiDi	80826
Microscope cover glass 24 x 40 mm	Bar Naor	BN1052421ECALN
Platinum iridium 0.25 mM wire	World Precision Instruments	PT1002
Instruments
Cell counter CellDrop BF	DeNovix	CellDrop BF-UNLTD
Microspin FV-2400	Biosan	BS-010201-AAA
Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements software	Nikon	CSU-W1
Olympus SZ61 stereo microscope	Olympus	SZ61
pH meter	Mettler-Toledo	MT30019032
Revolver Adjustable Lab Rotator	Labnet	H5600