Обнаружение митофагии в клетках Caenorhabditis elegans и млекопитающих с использованием органеллоспецифических красителей

Summary

Изучение митофагии с помощью электронной микроскопии, генетических датчиков и иммунофлуоресценции требует дорогостоящего оборудования, квалифицированного персонала и значительных затрат времени. Здесь мы демонстрируем эффективность коммерческого набора флуоресцентных красителей в количественной оценке процесса митофагии как у Caenorhabditis elegans, так и у клеточной линии рака печени.

Abstract

Митохондрии необходимы для различных биологических функций, включая производство энергии, липидный обмен, гомеостаз кальция, биосинтез гема, регулируемую гибель клеток и образование активных форм кислорода (АФК). АФК жизненно важны для ключевых биологических процессов. Однако при отсутствии контроля они могут привести к окислительному повреждению, включая повреждение митохондрий. Поврежденные митохондрии высвобождают больше АФК, тем самым усиливая повреждение клеток и болезненное состояние. Гомеостатический процесс, называемый митохондриальной аутофагией (митофагией), избирательно удаляет поврежденные митохондрии, которые затем заменяются новыми. Существует несколько путей митофагии, общей конечной точкой которых является разрушение поврежденных митохондрий в лизосомах.

Несколько методологий, включая генетические датчики, иммунофлуоресценцию антител и электронную микроскопию, используют эту конечную точку для количественной оценки митофагии. Каждый метод исследования митофагии имеет свои преимущества, такие как специфическое нацеливание на ткани / клетки (с помощью генетических датчиков) и большая детализация (с помощью электронной микроскопии). Однако эти методы часто требуют дорогостоящих ресурсов, обученного персонала и длительного времени подготовки перед фактическим экспериментом, например, для создания трансгенных животных. Здесь мы представляем экономически эффективную альтернативу для измерения митофагии с использованием коммерчески доступных флуоресцентных красителей, нацеленных на митохондрии и лизосомы. Этот метод эффективно измеряет митофагию у нематоды Caenorhabditis elegans и клеток печени человека, что указывает на его потенциальную эффективность в других модельных системах.

Introduction

Митохондрии необходимы для всех аэробных животных, включая человека. Они преобразуют химическую энергию биомолекул в аденозинтрифосфат (АТФ) посредством окислительного фосфорилирования¹, синтезируют гем², разлагают жирные кислоты β окисления³, регулируют гомеостаз кальция⁴ и железа⁵ , контролируют гибель клеток путем апоптоза⁶ и генерируют активные формы кислорода (АФК), которые играют жизненно важную роль в окислительно-восстановительном гомеостазе⁷. Два взаимодополняющих и противоположных про....

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Для удобства читателей мы разделили протокол на две части: одна посвящена протоколу измерения митофагии у C. elegans, а другая - протоколу измерения митофагии в клетках печени. С перечнем материалов можно ознакомиться в Таблице предоставленных материалов .

Discussion

Множественные пути митофагии включают различные белки и биомолекулы (например, кардиолипин²⁹). Однако конечная точка этих путей аналогична — деградация митохондрий лизосомальными ферментами^12,13. Действительно, несколько методов используют .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent or resource
Analytical balance	Mettler-Toledo
Bacto Agar	BD-Difco	214010
Bacto Peptone	BD-Difco	211677
Bacto Tryptone	BD-Difco	211705
Bacto Yeast extract	BD-Difco	212750
Calcium chloride	Sigma	C1016
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)	Sigma	C2920
Chemicals
Cholestrol	Thermo Fisher	C/5360/48
DMEM high glucose	Biological Industries	01-055-1A
Double distilled water (DDW)
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Biological Industries	02-023-1A
FBS heat inactivated	Invitrogen	M7514
Gluteradehyde (25%)	Sigma	G5882
HEPES Buffer 1 M	Biological Industries	03-025-1B
L-gluatamine	Biological Industries	03-020-1B
Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter Reagent	Abcam	ab139487
Magnesium Sulfate	Sigma	M7506
Nonidet P 40	Sigma	74385
Paraformalydehyde (16%)	Electron Microscopy Sciences	15720
Poloxamer 188 Solution	Sigma	P5556
Potassium dihydrogen phosphate	Millipore	1.04873.1000
Potassium phosphate dibasic	Sigma	P3786
SeaKem LE Agarose	Lonza	50004
Sodium Chloride	Bio-Lab	1903059100
Sodium Hydroxide	Gadot	1310732
Sodium phosphate dibasic dodecahydrate	Sigma	4273
Tetracycline hydrochloride	Sigma	87128-25G
Trypsin-EDTA	Biological Industries	03-052-1A
VL-850: 1,8-diaminooxy-octane	Patented
Glass/Plastic Disposables
0.22 μm syringe filter	Millex GV	SLGV033RS
1.7 mL Micro Centrifuge Tubes	Lifegene	LMCT1.7B-500
10 cm Petri plates	Corning	430167
1,000 mL Erlenmeyer Flask	IsoLab, Germany
15 mL Sterile Polypropylene tube	Lifegene	LTB15-500
35 mm Petri dishes	Bar Naor	BN9015810
500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μm	Lifegene	LG-FPE205500S
50 mL Sterile Polypropylene tube	Lifegene	LTB50-500
Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mm	Marienfeld	101152
Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glass	Pyrex	99445-13
iBiDi 8 well μ-slides	iBiDi	80826
Microscope cover glass 24 x 40 mm	Bar Naor	BN1052421ECALN
Platinum iridium 0.25 mM wire	World Precision Instruments	PT1002
Instruments
Cell counter CellDrop BF	DeNovix	CellDrop BF-UNLTD
Microspin FV-2400	Biosan	BS-010201-AAA
Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements software	Nikon	CSU-W1
Olympus SZ61 stereo microscope	Olympus	SZ61
pH meter	Mettler-Toledo	MT30019032
Revolver Adjustable Lab Rotator	Labnet	H5600