שימור מולקולרי אוניברסלי עם מיקרוסקופ הרחבה פי 11

Summary

מוצגת כאן גרסה חדשה של מיקרוסקופ הרחבה (ExM), Magnify, המותאמת להרחבה של עד פי 11, תוך שימור מערך מקיף של מחלקות ביומולקולות, ותואמת למגוון רחב של סוגי רקמות. הוא מאפשר לחקור את התצורה הננומטרית של ביומולקולות באמצעות מיקרוסקופים קונבנציונליים מוגבלי עקיפה.

Abstract

הדמיה ננומטרית של דגימות ביולוגיות יכולה לשפר את ההבנה של פתוגנזה של מחלות. בשנים האחרונות, מיקרוסקופ הרחבה (ExM) הוכח כחלופה יעילה וזולה למיקרוסקופ אופטי ברזולוציית על. עם זאת, הוא הוגבל על ידי הצורך בסוכני עיגון ספציפיים ולעתים קרובות מותאמים אישית כדי לשמור על מחלקות ביומולקולות שונות בתוך הג'ל ועל ידי קשיים בהרחבת פורמטים סטנדרטיים של דגימות קליניות, כגון רקמה משובצת פרפין קבועה פורמלין, במיוחד אם רוצים גורמי התפשטות גדולים יותר או אפיטופים חלבוניים משומרים. במאמר זה אנו מתארים את Magnify, שיטת ExM חדשה להרחבה חזקה עד פי 11 במגוון רחב של סוגי רקמות. על ידי שימוש במתקרולאין כעוגן כימי בין הרקמה לג'ל, Magnify שומרת על ביומולקולות מרובות, כגון חלבונים, שומנים וחומצות גרעין, בתוך הג'ל, ובכך מאפשרת הדמיה ננומטרית רחבה של רקמות על מיקרוסקופים אופטיים קונבנציונליים. פרוטוקול זה מתאר שיטות עבודה מומלצות כדי להבטיח הרחבת רקמות חזקה ונטולת סדקים, כמו גם טיפים לטיפול והדמיה של ג'לים מורחבים מאוד.

Introduction

מערכות ביולוגיות מפגינות הטרוגניות מבנית, החל מהגפיים והאיברים ועד לרמות החלבונים בסקאלה הננומטרית. לכן, הבנה מלאה של פעולת מערכות אלה מחייבת בחינה ויזואלית על פני קני מידה אלה. עם זאת, מגבלת העקיפה של האור גורמת לאתגרים בהדמיה של מבנים קטנים מ~200-300 ננומטר במיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי. בנוסף, שיטות אופטיות ברזולוציית על ^1,2,3, כגון דלדול פליטה מגורה (STED), מיקרוסקופ לוקליזציה מופעל אור (PALM), מיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי (STORM) ומיקרוסקופ תאורה מובנה (SIM), למרות שהן חזקות, מציבות אתגרים משלהן^, מכיוון שהן דורשות חומרה וריאגנטים יקרים ולעתים קרובות יש להן זמני רכישה איטיים ויכולת ירודה ל....

Protocol

כל ההליכים הניסיוניים המערבים בעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת קרנגי מלון. דגימות רקמה אנושית הושגו באופן מסחרי.

1. הכנת ריאגנטים מלאי ופתרונות

הערה: עיין

Discussion

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול Magnify¹⁷, גרסת ExM שיכולה לשמור על ביומולקולות מרובות עם עוגן כימי יחיד ולהרחיב דגימות קליניות מאתגרות של FFPE עד פי 11 עם דנטורציה של חום. השינויים העיקריים בפרוטוקול זה המבדילים אותו מפרוטוקולי ExM אחרים כוללים שימוש בג'ל מנוסח מחדש שנשאר חזק מכנית גם כאשר .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-hydroxy-TEMPO (4HT)	Sigma Aldrich	176141	Inhibitor
6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass)	Cellvis	P06-1.5H-N
Acrylamide	Sigma Aldrich	A8887	Gel Monomer component
Ammonium persulfate (APS)	Sigma Aldrich	A3678	Initiatior
DAPI (1 mg/mL)	Thermo Scientific	62248
Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10)	Sigma Aldrich	P9769	Non-ionic surfactant
Diamond knife No. 88 CM	General Tools	31116
Ethanol	Pharmco	111000200
Ethanol	Pharmco	111000200
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M	VWR	BDH7830-1	Homogenization Buffer Component
Forceps
Glycine	Sigma Aldrich	G8898	Homogenization Buffer Component
Heparin	Sigma Aldrich	H3393
Methacrolein	Sigma Aldrich	133035	Anchoring Agent
Micro cover Glass #1 (24x60mm)	VWR	48393 106
Micro cover Glass #1.5 (24x60mm)	VWR	48393 251
N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma Aldrich	T9281	Accelerator
N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis)	Sigma Aldrich	M7279	Gel Monomer component
N,N-dimethylacrylamide (DMAA)	Sigma Aldrich	274135	Gel Monomer component
Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish	Thermo Fisher	167063
Nunclon 6-Well Cell Culture Dish	Thermo Fisher	140675
Nunc™ 15mL Conical	Thermo Fisher	339651
Nunc™ 50mL Conical	Thermo Fisher	339653
Orbital Shaker
Paint brush
pH Meter
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution	Fischer Scientific	BP399-1
Polyethylene glycol  200	Sigma Aldrich	P-3015
Proteinase K (Molecular Biology Grade)	Thermo Scientific	EO0491
Razor blade	Fischer Scientifc	12640
Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL	Thermo Fisher	3457
Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL	Thermo Fisher	3459
Sodium acrylate (SA)	AK Scientific	R624	Gel Monomer component
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S6191
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma Aldrich	C8532-1KG
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	L3771	Homogenization Buffer Component
Tris Base	Fischer Scientific	BP152-1	Homogenization Buffer Component
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Urea	Sigma Aldrich	U5378	Homogenization Buffer Component
Xylenes	Sigma Aldrich	214736
20x SSC	Thermo Scientific	AM9763
Tween20	Sigma Aldrich	P1379
poly-L-lysine	Sigma Aldrich	P8920