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Apresentamos aqui uma nova versão da microscopia de expansão (ExM), Magnify, que é modificada para expansão de até 11 vezes, conservando uma ampla gama de classes de biomoléculas, e é compatível com uma ampla gama de tipos de tecidos. Ele permite a interrogação da configuração em nanoescala de biomoléculas usando microscópios convencionais limitados por difração.
A obtenção de imagens em nanoescala de espécimes biológicos pode melhorar a compreensão da patogênese de doenças. Nos últimos anos, a microscopia de expansão (ExM) tem se mostrado uma alternativa eficaz e de baixo custo à microscopia óptica de super-resolução. No entanto, tem sido limitada pela necessidade de agentes de ancoragem específicos e muitas vezes personalizados para reter diferentes classes de biomoléculas dentro do gel e por dificuldades com a expansão de formatos de amostras clínicas padrão, como tecido fixado em formalina e embebido em parafina, especialmente se fatores de expansão maiores ou epítopos proteicos preservados forem desejados. Aqui, descrevemos o Magnify, um novo método ExM para expansão robusta de até 11 vezes em uma ampla gama de tipos de tecido. Ao usar a metacroleína como âncora química entre o tecido e o gel, o Magnify retém múltiplas biomoléculas, como proteínas, lipídios e ácidos nucléicos, dentro do gel, permitindo assim a obtenção de imagens em larga escala nanoescala dos tecidos em microscópios ópticos convencionais. Este protocolo descreve as melhores práticas para garantir uma expansão de tecido robusta e livre de rachaduras, bem como dicas para manuseio e geração de imagens de géis altamente expandidos.
Os sistemas biológicos exibem heterogeneidade estrutural, desde os membros e órgãos até os níveis de proteínas na nanoescala. Portanto, uma compreensão completa do funcionamento desses sistemas requer um exame visual através dessas escalas de tamanho. No entanto, o limite de difração da luz causa desafios na visualização de estruturas menores que ~200-300 nm em um microscópio de fluorescência convencional. Além disso, os métodos ópticos de super-resolução 1,2,3, como a depleção de emissão estimulada (STED), a microscopia de localização fotoativada (PALM), a microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM) e a microscopia de ilu....
Todos os procedimentos experimentais envolvendo animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes do National Institutes of Health (NIH) e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Carnegie Mellon. Amostras de tecido humano foram obtidas comercialmente.
1. Preparação dos reagentes e soluções de estoque
NOTA: Consulte a Tabela de materiais para obter uma lista dos reagentes usados.
Se o protocolo tiver sido concluído com sucesso (Figura 1), a amostra aparecerá clara e plana após a desnaturação por calor; qualquer dobramento ou enrugamento indica homogeneização incompleta. Uma amostra expandida com sucesso será 3-4,5 vezes maior do que antes da expansão em 1x PBS e 8-11 vezes maior quando totalmente expandida em ddH2O. A Figura 3 mostra imagens de exemplo pré e pós-expansão de amostra de rim humano FFPE de 5 μm de es.......
Aqui, apresentamos o protocolo Magnify 17, uma variante de ExM que pode reter múltiplas biomoléculas com uma única ancoragem química e expandir espécimes clínicos FFPE desafiadores até11 vezes com desnaturação térmica. As principais mudanças neste protocolo que o distinguem de outros protocolos ExM incluem o uso de um gel reformulado que permanece mecanicamente robusto mesmo quando totalmente expandido, bem como o uso de metacroleína como âncora da biomolécula. As etapas mais crític.......
Este trabalho foi apoiado pela Carnegie Mellon University e pela D.S.F. Charitable Foundation (Y.Z. e X.R.), pelo National Institutes of Health (N.I.H.) Prêmio Novo Inovador do Diretor DP2 OD025926-01 e Fundação Kauffman.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | Gel Monomer component |
Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | |
Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10) | Sigma Aldrich | P9769 | Non-ionic surfactant |
Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M | VWR | BDH7830-1 | Homogenization Buffer Component |
Forceps | |||
Glycine | Sigma Aldrich | G8898 | Homogenization Buffer Component |
Heparin | Sigma Aldrich | H3393 | |
Methacrolein | Sigma Aldrich | 133035 | Anchoring Agent |
Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis) | Sigma Aldrich | M7279 | Gel Monomer component |
N,N-dimethylacrylamide (DMAA) | Sigma Aldrich | 274135 | Gel Monomer component |
Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | |
Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
Nunc™ 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
Nunc™ 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
Orbital Shaker | |||
Paint brush | |||
pH Meter | |||
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientific | BP399-1 | |
Polyethylene glycol 200 | Sigma Aldrich | P-3015 | |
Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
Sodium acrylate (SA) | AK Scientific | R624 | Gel Monomer component |
Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Homogenization Buffer Component |
Tris Base | Fischer Scientific | BP152-1 | Homogenization Buffer Component |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Homogenization Buffer Component |
Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 | |
20x SSC | Thermo Scientific | AM9763 | |
Tween20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
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