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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Apresentamos aqui uma nova versão da microscopia de expansão (ExM), Magnify, que é modificada para expansão de até 11 vezes, conservando uma ampla gama de classes de biomoléculas, e é compatível com uma ampla gama de tipos de tecidos. Ele permite a interrogação da configuração em nanoescala de biomoléculas usando microscópios convencionais limitados por difração.

Abstract

A obtenção de imagens em nanoescala de espécimes biológicos pode melhorar a compreensão da patogênese de doenças. Nos últimos anos, a microscopia de expansão (ExM) tem se mostrado uma alternativa eficaz e de baixo custo à microscopia óptica de super-resolução. No entanto, tem sido limitada pela necessidade de agentes de ancoragem específicos e muitas vezes personalizados para reter diferentes classes de biomoléculas dentro do gel e por dificuldades com a expansão de formatos de amostras clínicas padrão, como tecido fixado em formalina e embebido em parafina, especialmente se fatores de expansão maiores ou epítopos proteicos preservados forem desejados. Aqui, descrevemos o Magnify, um novo método ExM para expansão robusta de até 11 vezes em uma ampla gama de tipos de tecido. Ao usar a metacroleína como âncora química entre o tecido e o gel, o Magnify retém múltiplas biomoléculas, como proteínas, lipídios e ácidos nucléicos, dentro do gel, permitindo assim a obtenção de imagens em larga escala nanoescala dos tecidos em microscópios ópticos convencionais. Este protocolo descreve as melhores práticas para garantir uma expansão de tecido robusta e livre de rachaduras, bem como dicas para manuseio e geração de imagens de géis altamente expandidos.

Introduction

Os sistemas biológicos exibem heterogeneidade estrutural, desde os membros e órgãos até os níveis de proteínas na nanoescala. Portanto, uma compreensão completa do funcionamento desses sistemas requer um exame visual através dessas escalas de tamanho. No entanto, o limite de difração da luz causa desafios na visualização de estruturas menores que ~200-300 nm em um microscópio de fluorescência convencional. Além disso, os métodos ópticos de super-resolução 1,2,3, como a depleção de emissão estimulada (STED), a microscopia de localização fotoativada (PALM), a microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM) e a microscopia de ilu....

Protocol

Todos os procedimentos experimentais envolvendo animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes do National Institutes of Health (NIH) e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Carnegie Mellon. Amostras de tecido humano foram obtidas comercialmente.

1. Preparação dos reagentes e soluções de estoque

NOTA: Consulte a Tabela de materiais para obter uma lista dos reagentes usados.

Representative Results

Se o protocolo tiver sido concluído com sucesso (Figura 1), a amostra aparecerá clara e plana após a desnaturação por calor; qualquer dobramento ou enrugamento indica homogeneização incompleta. Uma amostra expandida com sucesso será 3-4,5 vezes maior do que antes da expansão em 1x PBS e 8-11 vezes maior quando totalmente expandida em ddH2O. A Figura 3 mostra imagens de exemplo pré e pós-expansão de amostra de rim humano FFPE de 5 μm de es.......

Discussion

Aqui, apresentamos o protocolo Magnify 17, uma variante de ExM que pode reter múltiplas biomoléculas com uma única ancoragem química e expandir espécimes clínicos FFPE desafiadores até11 vezes com desnaturação térmica. As principais mudanças neste protocolo que o distinguem de outros protocolos ExM incluem o uso de um gel reformulado que permanece mecanicamente robusto mesmo quando totalmente expandido, bem como o uso de metacroleína como âncora da biomolécula. As etapas mais crític.......

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela Carnegie Mellon University e pela D.S.F. Charitable Foundation (Y.Z. e X.R.), pelo National Institutes of Health (N.I.H.) Prêmio Novo Inovador do Diretor DP2 OD025926-01 e Fundação Kauffman.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
4-hydroxy-TEMPO (4HT)Sigma Aldrich176141Inhibitor
6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass)CellvisP06-1.5H-N
AcrylamideSigma AldrichA8887Gel Monomer component
Ammonium persulfate (APS) Sigma AldrichA3678Initiatior
DAPI (1 mg/mL)Thermo Scientific62248
Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10)Sigma AldrichP9769Non-ionic surfactant
Diamond knife No. 88 CMGeneral Tools31116
EthanolPharmco111000200
EthanolPharmco111000200
Ethylenediaminetetraacetic
acid (EDTA) 0.5 M
VWRBDH7830-1Homogenization Buffer Component
Forceps
GlycineSigma AldrichG8898Homogenization Buffer Component
HeparinSigma AldrichH3393
MethacroleinSigma Aldrich133035Anchoring Agent
Micro cover Glass #1 (24x60mm)VWR48393 106
Micro cover Glass #1.5 (24x60mm)VWR48393 251
N,N,N′,N′-
Tetramethylethylenediamine (TEMED)
Sigma AldrichT9281Accelerator
N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis)Sigma AldrichM7279Gel Monomer component
N,N-dimethylacrylamide (DMAA)Sigma Aldrich274135Gel Monomer component
Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture DishThermo Fisher167063
Nunclon 6-Well Cell Culture DishThermo Fisher140675
Nunc™ 15mL ConicalThermo Fisher339651
Nunc™ 50mL ConicalThermo Fisher339653
Orbital Shaker
Paint brush
pH Meter
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x SolutionFischer ScientificBP399-1
Polyethylene glycol  200Sigma AldrichP-3015
Proteinase K (Molecular Biology Grade)Thermo ScientificEO0491
Razor bladeFischer Scientifc12640
Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mLThermo Fisher3457
Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mLThermo Fisher3459
Sodium acrylate (SA)AK ScientificR624Gel Monomer component
Sodium azideSigma AldrichS2002
Sodium chlorideSigma AldrichS6191
Sodium citrate tribasic dihydrateSigma AldrichC8532-1KG
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Sigma AldrichL3771Homogenization Buffer Component
Tris BaseFischer ScientificBP152-1Homogenization Buffer Component
Triton X-100Sigma AldrichT8787
UreaSigma AldrichU5378Homogenization Buffer Component
XylenesSigma Aldrich214736
20x SSCThermo ScientificAM9763
Tween20Sigma AldrichP1379
poly-L-lysine Sigma AldrichP8920

References

  1. Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
  2. Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79

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