Retenção molecular universal com microscopia de expansão de 11 vezes

Summary

Apresentamos aqui uma nova versão da microscopia de expansão (ExM), Magnify, que é modificada para expansão de até 11 vezes, conservando uma ampla gama de classes de biomoléculas, e é compatível com uma ampla gama de tipos de tecidos. Ele permite a interrogação da configuração em nanoescala de biomoléculas usando microscópios convencionais limitados por difração.

Abstract

A obtenção de imagens em nanoescala de espécimes biológicos pode melhorar a compreensão da patogênese de doenças. Nos últimos anos, a microscopia de expansão (ExM) tem se mostrado uma alternativa eficaz e de baixo custo à microscopia óptica de super-resolução. No entanto, tem sido limitada pela necessidade de agentes de ancoragem específicos e muitas vezes personalizados para reter diferentes classes de biomoléculas dentro do gel e por dificuldades com a expansão de formatos de amostras clínicas padrão, como tecido fixado em formalina e embebido em parafina, especialmente se fatores de expansão maiores ou epítopos proteicos preservados forem desejados. Aqui, descrevemos o Magnify, um novo método ExM para expansão robusta de até 11 vezes em uma ampla gama de tipos de tecido. Ao usar a metacroleína como âncora química entre o tecido e o gel, o Magnify retém múltiplas biomoléculas, como proteínas, lipídios e ácidos nucléicos, dentro do gel, permitindo assim a obtenção de imagens em larga escala nanoescala dos tecidos em microscópios ópticos convencionais. Este protocolo descreve as melhores práticas para garantir uma expansão de tecido robusta e livre de rachaduras, bem como dicas para manuseio e geração de imagens de géis altamente expandidos.

Introduction

Os sistemas biológicos exibem heterogeneidade estrutural, desde os membros e órgãos até os níveis de proteínas na nanoescala. Portanto, uma compreensão completa do funcionamento desses sistemas requer um exame visual através dessas escalas de tamanho. No entanto, o limite de difração da luz causa desafios na visualização de estruturas menores que ~200-300 nm em um microscópio de fluorescência convencional. Além disso, os métodos ópticos de super-resolução ^1,2,3, como a depleção de emissão estimulada (STED), a microscopia de localização fotoativada (PALM), a microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM) e a microscopia de ilu....

Protocol

Todos os procedimentos experimentais envolvendo animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes do National Institutes of Health (NIH) e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Carnegie Mellon. Amostras de tecido humano foram obtidas comercialmente.

1. Preparação dos reagentes e soluções de estoque

NOTA: Consulte a Tabela de materiais para obter uma lista dos reagentes usados.

Discussion

Aqui, apresentamos o protocolo Magnify 17, uma variante de ExM que pode reter múltiplas biomoléculas com uma única ancoragem química e expandir espécimes clínicos FFPE desafiadores até¹¹ vezes com desnaturação térmica. As principais mudanças neste protocolo que o distinguem de outros protocolos ExM incluem o uso de um gel reformulado que permanece mecanicamente robusto mesmo quando totalmente expandido, bem como o uso de metacroleína como âncora da biomolécula. As etapas mais crític.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-hydroxy-TEMPO (4HT)	Sigma Aldrich	176141	Inhibitor
6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass)	Cellvis	P06-1.5H-N
Acrylamide	Sigma Aldrich	A8887	Gel Monomer component
Ammonium persulfate (APS)	Sigma Aldrich	A3678	Initiatior
DAPI (1 mg/mL)	Thermo Scientific	62248
Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10)	Sigma Aldrich	P9769	Non-ionic surfactant
Diamond knife No. 88 CM	General Tools	31116
Ethanol	Pharmco	111000200
Ethanol	Pharmco	111000200
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M	VWR	BDH7830-1	Homogenization Buffer Component
Forceps
Glycine	Sigma Aldrich	G8898	Homogenization Buffer Component
Heparin	Sigma Aldrich	H3393
Methacrolein	Sigma Aldrich	133035	Anchoring Agent
Micro cover Glass #1 (24x60mm)	VWR	48393 106
Micro cover Glass #1.5 (24x60mm)	VWR	48393 251
N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma Aldrich	T9281	Accelerator
N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis)	Sigma Aldrich	M7279	Gel Monomer component
N,N-dimethylacrylamide (DMAA)	Sigma Aldrich	274135	Gel Monomer component
Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish	Thermo Fisher	167063
Nunclon 6-Well Cell Culture Dish	Thermo Fisher	140675
Nunc™ 15mL Conical	Thermo Fisher	339651
Nunc™ 50mL Conical	Thermo Fisher	339653
Orbital Shaker
Paint brush
pH Meter
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution	Fischer Scientific	BP399-1
Polyethylene glycol  200	Sigma Aldrich	P-3015
Proteinase K (Molecular Biology Grade)	Thermo Scientific	EO0491
Razor blade	Fischer Scientifc	12640
Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL	Thermo Fisher	3457
Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL	Thermo Fisher	3459
Sodium acrylate (SA)	AK Scientific	R624	Gel Monomer component
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S6191
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma Aldrich	C8532-1KG
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	L3771	Homogenization Buffer Component
Tris Base	Fischer Scientific	BP152-1	Homogenization Buffer Component
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Urea	Sigma Aldrich	U5378	Homogenization Buffer Component
Xylenes	Sigma Aldrich	214736
20x SSC	Thermo Scientific	AM9763
Tween20	Sigma Aldrich	P1379
poly-L-lysine	Sigma Aldrich	P8920