Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Здесь представлена новая версия расширительной микроскопии (ExM) Magnify, которая модифицирована для расширения до 11 раз, сохраняет широкий спектр классов биомолекул и совместима с широким спектром типов тканей. Он позволяет исследовать наноразмерную конфигурацию биомолекул с помощью обычных дифракционно-ограниченных микроскопов.

Abstract

Наноразмерная визуализация биологических образцов может улучшить понимание патогенеза заболевания. В последние годы было продемонстрировано, что расширительная микроскопия (ExM) является эффективной и недорогой альтернативой оптической микроскопии сверхвысокого разрешения. Тем не менее, он был ограничен потребностью в специфических и часто индивидуальных якорных агентах для удержания различных классов биомолекул в геле, а также трудностями с расширением стандартных форматов клинических образцов, таких как фиксированная формалином парафинообразная ткань, особенно если требуются более крупные факторы расширения или сохраненные белковые эпитопы. В этой статье мы опишем Magnify, новый метод ExM для надежного расширения до 11 раз в широком спектре типов тканей. Используя метакролеин в качестве химического якоря между тканью и гелем, Magnify удерживает несколько биомолекул, таких как белки, липиды и нуклеиновые кислоты, внутри геля, что позволяет получать широкие наноразмерные изображения тканей на обычных оптических микроскопах. В этом протоколе описаны рекомендации по обеспечению прочного и свободного от трещин расширения тканей, а также советы по обращению и визуализации сильно расширенных гелей.

Introduction

Биологические системы демонстрируют структурную гетерогенность, начиная от конечностей и органов и заканчивая уровнями белков на наноуровне. Таким образом, полное понимание работы этих систем требует визуального осмотра в этих размерных масштабах. Однако дифракционный предел света вызывает трудности при визуализации структур размером менее ~200-300 нм с помощью обычного флуоресцентного микроскопа. Кроме того, оптические методысверхвысокого разрешения 1,2,3, такие как истощение вынужденного излучения (STED), фотоактивируемая локализационная микроскопия (PALM), стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия (STORM) и микроскопия структур....

Protocol

Все экспериментальные процедуры с участием животных проводились в соответствии с рекомендациями Национальных институтов здравоохранения (NIH) и были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете Карнеги-Меллона. Образцы тканей человека были получены в про.......

Representative Results

Если протокол был успешно завершен (рис. 1), образец будет выглядеть чистым и плоским после термической денатурации; Любая складка или сморщивание указывает на неполную гомогенизацию. Успешно расширенный образец будет в 3-4,5 раза больше, чем до расширения в 1x PBS, и в 8-11 раз ?.......

Discussion

Здесь мы представляем протокол Magnify 17, вариант ExM, который может удерживать несколько биомолекул с помощью одного химического якоря и расширять сложные клинические образцы FFPE до11 раз с помощью тепловой денатурации. Ключевые изменения в этом протоколе, которые отличают его .......

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Университетом Карнеги-Меллона и Благотворительным фондом D.S.F. (Y.Z. и X.R.), Национальными институтами здравоохранения (N.I.H.) Премия режиссера «Новый инноватор» DP2 OD025926-01 и Фонд Кауфмана.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
4-hydroxy-TEMPO (4HT)Sigma Aldrich176141Inhibitor
6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass)CellvisP06-1.5H-N
AcrylamideSigma AldrichA8887Gel Monomer component
Ammonium persulfate (APS) Sigma AldrichA3678Initiatior
DAPI (1 mg/mL)Thermo Scientific62248
Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10)Sigma AldrichP9769Non-ionic surfactant
Diamond knife No. 88 CMGeneral Tools31116
EthanolPharmco111000200
EthanolPharmco111000200
Ethylenediaminetetraacetic
acid (EDTA) 0.5 M
VWRBDH7830-1Homogenization Buffer Component
Forceps
GlycineSigma AldrichG8898Homogenization Buffer Component
HeparinSigma AldrichH3393
MethacroleinSigma Aldrich133035Anchoring Agent
Micro cover Glass #1 (24x60mm)VWR48393 106
Micro cover Glass #1.5 (24x60mm)VWR48393 251
N,N,N′,N′-
Tetramethylethylenediamine (TEMED)
Sigma AldrichT9281Accelerator
N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis)Sigma AldrichM7279Gel Monomer component
N,N-dimethylacrylamide (DMAA)Sigma Aldrich274135Gel Monomer component
Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture DishThermo Fisher167063
Nunclon 6-Well Cell Culture DishThermo Fisher140675
Nunc™ 15mL ConicalThermo Fisher339651
Nunc™ 50mL ConicalThermo Fisher339653
Orbital Shaker
Paint brush
pH Meter
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x SolutionFischer ScientificBP399-1
Polyethylene glycol  200Sigma AldrichP-3015
Proteinase K (Molecular Biology Grade)Thermo ScientificEO0491
Razor bladeFischer Scientifc12640
Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mLThermo Fisher3457
Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mLThermo Fisher3459
Sodium acrylate (SA)AK ScientificR624Gel Monomer component
Sodium azideSigma AldrichS2002
Sodium chlorideSigma AldrichS6191
Sodium citrate tribasic dihydrateSigma AldrichC8532-1KG
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Sigma AldrichL3771Homogenization Buffer Component
Tris BaseFischer ScientificBP152-1Homogenization Buffer Component
Triton X-100Sigma AldrichT8787
UreaSigma AldrichU5378Homogenization Buffer Component
XylenesSigma Aldrich214736
20x SSCThermo ScientificAM9763
Tween20Sigma AldrichP1379
poly-L-lysine Sigma AldrichP8920

References

  1. Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
  2. Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79

Explore More Articles

JoVE200

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved