نشكر أعضاء مختبري سوميغراي وأمين على مناقشاتهم المدروسة. تم دعم هذا العمل من خلال منحة مؤسسة تشارلز إتش هود لصحة الطفل ومنحة مؤسسة التليف الكيسي (004741P222) إلى KS والمعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى التابع للمعاهد الوطنية للصحة إلى NA بموجب الجائزة رقم 2R01DK077065-12.

عزل خبايا الفئران المعوية وتوليد المواد العضوية المعوية

يحافظ تطوير نموذج عضوي معوي للفئران على الخصائص الوظيفية المهمة الموجودة في العضو في الجسم الحي وهو أداة واعدة للاختبار قبل السريري وفحص الأدوية والمقايسات الوظيفية. يمكن استخدام هذا النموذج في المختبر بالتوازي مع دراسات أمراض الجهاز الهضمي قبل السريرية في الجسم الحي ، والتي غالبا ما تكون الفئران نموذجا مفضلا لها بسبب حجمها المعوي الأكبر ، والجوانب الفسيولوجية المشتركة مع البشر ، وفي بعض الحالات تكون نماذج مرض أفضل38. هنا ، تم تحديد بروتوكول قوي خطوة بخطوة لعزل الخبايا المعوية للفئران ، وتوليد وثقافة طويلة الأجل من عضويات معوية الفئران ، بالإضافة إلى تطبيقات المصب بما في ذلك فحوصات تورم فورسكولين الوظيفية ، وتألق مناعي كامل ، وثقافة أحادية الطبقة 2D ، والتلاعب الجيني للفيروسات العدسية. من المحتمل أن تكون العضويات المعوية للفئران ذات صلة في العديد من سياقات المرض حيث تكون الفيزيولوجيا المرضية لنماذج الفئران غير مناسبة وقد توفر نموذجا أفضل لفسيولوجيا الأمعاء البشرية مقارنة بالعضوية المعوية للفئران.
لإنشاء ثقافات عضوية طويلة العمر يمكن تمريرها وتوسيعها ، من الضروري تحديد عوامل النمو الرئيسية المطلوبة للحفاظ على الانتشار الظهاري المعوي. غالبا ما تزرع عضويات الفأر في كوكتيل بسيط من EGF و R-spondin و Noggin ، على الرغم من أنه تم الإبلاغ عن أن Noggin ليس ضروريا لثقافة الأعضاء المعوية39. يمكن أن تحل الوسائط المكيفة محل عوامل النمو المؤتلفة وخطوط الخلايا الأكثر استخداما هي L-WRN ، والتي تفرز Wnt3a و Rspondin-3 و Noggin39 و L-Wnt3a و HA-Rspondin1-Fc 293Tالخلايا 40. الوسائط المكيفة L-WRN كافية لدعم ليس فقط نمو الفئرانالمعوية 39 العضوية ، ولكن نمو الكائنات العضوية المعوية من العديد من المزرعة والحيوانات المصاحبة ، بما في ذلك الكلاب والقطط والدجاج والخيول والأبقار والأغنام والخنازير12. ومع ذلك ، فإن الكائنات العضوية المعوية البشرية تختلف اختلافا كبيرا في متطلبات عامل النمو ، لأنها تتطلب تركيبات وسائط متميزة لمرحلة نموها التوسعي (أي التقدم من كرويات صغيرة إلى كبيرة) مقابل مرحلة تمايزها (أي توليد ونضج أنواع الخلايا المتمايزة)10. تعكس المتطلبات الإعلامية للعضويات المعوية للفئران عن كثب تلك الخاصة بوسائط النمو التوسعية للعضويات المعوية البشرية ، ومع ذلك ، على وجه الخصوص ، فإن عضويات الفئران قادرة على النمو والتمايز في هذه البيئة الإعلامية ، مما يبسط إلى حد كبير متطلبات الاستزراع الخاصة بهم. بينما ركزت محاولاتنا الأولية على إنشاء وتنمية عضويات معوية للفئران في وسائط مكيفة L-WRN ، كانت الثقافة طويلة المدى ضعيفة ، وعانت خطوط الأعضاء المعوية في الفئران من نقص المتانة (البيانات غير معروضة). قد يكون هذا بسبب تصميم خطوط خلايا L-WRN لإفراز R-spondin 3 ، بينما تم تصميم خط الخلايا 293T-Rspo1 الموصى به هنا لإفراز R-spondin 1. من الممكن أن تفضل الفئران والكائنات العضوية البشرية R-spondin 1 ، مما قد يفسر فشل خطوط الفئران العضوية في الوسائط المشروطة L-WRN.
لتلخيص الإعداد في الجسم الحي عن كثب ، من المهم تطوير ظروف الثقافة العضوية التي تسمح ببقاء الخلايا الجذعية وصيانتها وتكاثرها ، والتي يمكن أن تحافظ على دوران الخلايا وأحداث التمايز المتزامنة إلى أنواع خلايا منفصلة. لذلك ، يجب معايرة تركيزات البروتينات و / أو البروتينات المؤتلفة في الوسائط المكيفة بإحكام والتحكم فيها لتحقيق هذا التوازن المثالي. على وجه الخصوص ، تعد مستويات Wnt المثلى ضرورية لتجنب فقدان الثقافات العضوية المعوية. القليل جدا من Wnt في الوسائط المكيفة لن يكون قادرا على دعم النمو ، مما يؤدي إلى فقدان الخلايا الجذعية والموت العضوي اللاحق ؛ سيؤدي الإفراط في تنشيط Wnt إلى أن تكون المواد العضوية كيسي وغير متمايزة10. على الرغم من عدم تفصيلها هنا ، يوصى بشدة باختبار كل دفعة من الوسائط المكيفة L-Wnt3a و 293T-Rspo1 باستخدام مقايسة لوسيفيراز مراسل Wnt ، مثل خط خلية Topflash41. وقد وصفت الدراسات السابقة أن الدفعة المثلى من وسائط L-Wnt3a يجب أن تؤدي إلى زيادة الإشارة بمقدار 15 ضعفا عند 12.5٪ وزيادة الإشارة بمقدار 300 ضعف عند 50٪ ، مقارنة ب 1٪ L-Wnt3a10. نظرا لأن عضويات الفئران أكثر حساسية من عضويات الفئران لمتطلبات الاستزراع ، وخاصة مستويات تنشيط Wnt ، فإن خطوات مراقبة الجودة الإضافية هذه تساعد بشكل كبير في تسهيل متانة وموثوقية مزارع الفئران العضوية. نظرا لعدم توفر خط مراسل مماثل لاختبار نشاط Bmp وتركيزات Noggin النسبية في وسائط Noggin المكيفة ، فمن المستحسن استخدام Noggin المؤتلف عندما يكون ذلك ممكنا للتحكم بدقة في مستويات Noggin. في حين يمكن زراعة العضويات المعوية للفأر والحفاظ عليها في غياب Noggin39 ، لم تتم محاولة ذلك لمزارع الأعضاء المعوية للفئران.
بالإضافة إلى متطلبات زراعة الخلايا ، يعتمد الإنشاء الأولي الناجح لخط عضوي للفئران بشكل حاسم على الاستنفاد الفعال للزغابات المتمايزة أثناء عزل السرداب. تتسبب المستويات العالية من تلوث فيلار في موت القبو ، ويفترض أنه إما بسبب إشارات من الخلايا المحتضرة أو عزل العوامل الأساسية. لاستنفاد هذه الزغابات المتمايزة من المستحضرات الظهارية بدقة وثبات ، يوصى بإجراء عزلات ظهارية بمساعدة مجسم. يوفر الفحص البصري للظهارة التي يتم إطلاقها إشارة واضحة عند التخلص من PBS واستبداله (الشكل 1). لا ينبغي جمع الخبايا حتى يكون هناك استنفاد كاف للزغب. يتم تمييز خلايا فيلار بشكل نهائي ولا يمكنها توليد عضويات في الثقافة. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب المرور اللاحق للعضويات المعوية للفئران واستخدامها لأي تطبيق نهائي رعاية دقيقة. تؤدي الحضانة في كواشف التفكك لفترات زمنية أطول (10 دقائق) إلى موت كبير للخلايا وفقدان الخط العضوي.
هنا ، يتم وصف بروتوكول بسيط وسريع لتوليد أحاديات الأمعاء من عضويات الفئران. ركائز EME والكولاجين I لها تأثيرات مختلفة على الظهارة ، والتي يمكن الاستفادة منها اعتمادا على الغرض من الدراسة. يسمح EME بالالتصاق السريع والفعال للخلايا المفردة وتشكيل نتوءات الخلايا. في المقابل ، فإن طلاء السطح بالكولاجين يؤخر هذه العمليات. بمجرد أن تصل الطبقة الأحادية إلى التقاء 80٪ تقريبا ، تبدأ الخلايا المزروعة على EME في توليد هياكل عضوية 3D مرة أخرى. ومع ذلك ، فإنها تفتقر إلى الدعم المادي والكيميائي الكافي لمواصلة النمو. يمكن منع هذا الارتداد إلى الحالة العضوية عن طريق الحفاظ على أحادي الطبقات في EME عند التقاء 50٪ -80٪. إن إضافة EME المخفف إلى السطح القمي للطبقات الأحادية يعزز الانتعاش السريع وتشكيل المواد العضوية دي نوفو ، مما يولد مناطق التقارب بسرعة وسهولة أكبر. على سطح الكولاجين الأول ، يمكن للخلايا أن تشكل طبقة أحادية موحدة وتولد مجموعات صغيرة. ومع ذلك ، فإن إضافة الكولاجين الأول فوق الطبقات الأحادية لا يكفي للحث على تكوين عضوي. يجب تخفيف EME عند الإضافة إلى سطح الطبقة الأحادية ، حيث ستكون هناك مقاومة ميكانيكية أقوى للتغلب على العضو الناشئ. ومع ذلك ، فإن هذا EME المخفف لا يسمح بتكوين قوي للعضويات الكبيرة. يجب إزالة أي عضويات فئران تم إنشاؤها من جديد تنفصل بشكل طبيعي عن السطح على الفور ونقلها إلى EME غير المخفف حتى يمكن استعادة الدعم الهيكلي والنمو. نظرا لصغر حجم المواد العضوية في هذه الخطوة ، لا ينصح بمرور المواد العضوية حتى يتم إنشاء نمو قوي. الأهمية البيولوجية الكامنة وراء سبب قدرة EME على دعم إصلاح المواد العضوية ، ولكن ما إذا كان الكولاجين يمكنني القيام بذلك أم لا ، ليس واضحا. ومع ذلك ، كانت هناك تقارير تفيد بأن الخلايا المزروعة في الكولاجين ثلاثي الأبعاد لا يمكنها تكوين عضويات ناشئة42,43 أو دعم الصيانة طويلة الأجل. منتجات EME المتاحة تجاريا هي مخاليط غير متجانسة من البروتينات خارج الخلية ، في المقام الأول اللامينين والكولاجين IV44. ومن ثم، فإن التركيب المميز للبروتينات وقدرة الخلية الطلائية على التعامل مع المصفوفة خارج الخلية باستخدام معقدات خلوية مختلفة يمكن أن يسمح بإعادة البناء في EME ولكن ليس الكولاجين الأول. لم يتم اختبار ما إذا كان يمكن وضع أحاديات الطبقات المشتقة من الكولاجين I في EME لدعم تكوين الأعضاء ونموها.
يتم وصف التلاعب الجيني لنموذج العضو العضوي المعوي للفئران هنا ، ويتم تحديد بروتوكولات نقل lentiviral من organoids 3D والنقل العابر للطبقات أحادية 2D. للتغلب على الكفاءة المنخفضة لنقل العضوي lentiviral ، تم تطوير بروتوكول للانتقال العابر للطبقات أحادية 2D. يوفر التشكل المسطح والمجالات القمية المكشوفة للطبقات الأحادية وصولا أسهل إلى الفيروسات والمجمعات المحتوية على الحمض النووي. تم استخدام تعبير مراسل EGFP باستخدام ناقل pLJM1-EGFP للتحقق من صحة هذه التقنية. لوحظ تعبير مراسل GFP بعد 24 ساعة ، وتم الحفاظ عليه لمدة 5-6 أيام في طبقة أحادية. من المرجح أن يكون للدراسات المستقبلية التي تركز على نقل الفيروسات العدسية للطبقات الأحادية كفاءة أعلى من نقل العضوي 3D. باستخدام البروتوكولات المذكورة أعلاه ، يمكن إصلاح المواد العضوية 3D من أحادي الطبقات 2D المصابة لتسهيل إنشاء خطوط مستقرة. بحذر ، يمكن الحفاظ على خطوط الكائنات العضوية المعوية للفئران بنجاح لأكثر من عام ، وتبقى مستقرة على مدار العديد من الممرات ، وحفظها بالتبريد ، وإذابتها بنجاح ، وتعديلها وراثيا باستخدام نقل الفيروسات العدسية ، وبالتالي تلبية الحاجة إلى نموذج عضوي معوي يمكن الوصول إليه وقابل للتتبع في المختبر يحتفظ بالأهمية الفسيولوجية للبشر.

العمارة الظهارية المعوية الصغيرة البشرية والتكوين الخلوي معقدة ، مما يعكس وظائفها الفسيولوجية. يتمثل الدور الأساسي للأمعاء الدقيقة في امتصاص العناصر الغذائية من الطعام الذي يمر عبر تجويفها1. لتعظيم هذه الوظيفة ، يتم تنظيم سطح الأمعاء في نتوءات تشبه الأصابع تسمى الزغابات ، والتي تزيد من مساحة السطح الامتصاصية ، والغزوات الشبيهة بالكوب تسمى الخبايا ، والتي تضم الخلايا الجذعية وتعزلها. داخل الظهارة ، يتم إنشاء أنواع مختلفة من الخلايا الامتصاصية والإفرازية المتخصصة لأداء وظائف مميزة1. بسبب هذا التعقيد ، كان من الصعب نمذجة أنسجة مثل الأمعاء في خطوط الخلايا الخالدة عالية الممرات. ومع ذلك ، فإن دراسة الخلايا الجذعية ، وخاصة الخلايا الجذعية البالغة وآليات تمايزها ، سمحت بتطوير الثقافات العضوية المعوية 3D. أدى استخدام النماذج العضوية إلى تحويل المجال ، ويرجع ذلك جزئيا إلى تلخيصها لبعض المكونات المعمارية وعدم تجانس نوع الخلية الموجود في الأمعاء السليمة. يمكن زراعة الكائنات العضوية المعوية على المدى الطويل في المختبر بسبب الحفاظ على عدد الخلايا الجذعية النشطة2.
أصبحت الكائنات العضوية المعوية بسرعة نموذجا قابلا للتكيف لدراسة بيولوجيا الخلايا الجذعية ، وفسيولوجيا الخلية ، والأمراض الوراثية ، والتغذية 3,4 ، بالإضافة إلى أداة لتطوير طرق جديدة لتوصيل الأدوية5. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام المواد العضوية المشتقة من المريض لنمذجة الأمراض ، واكتشاف الأدوية ، وفحص العلاج الشخصي ، من بين أمور أخرى6،7،8،9. ومع ذلك ، لا تزال الكائنات العضوية المعوية البشرية تمثل تحديات. إن توافر الأنسجة ، ومتطلبات موافقة مجلس المراجعة المؤسسية ، والقضايا الأخلاقية تحد من الاستخدام الواسع النطاق للعينات البشرية. بالإضافة إلى ذلك ، تتطلب الكائنات العضوية المعوية البشرية المتولدة من الخبايا المعوية شرطين متميزين للثقافة للحفاظ على الخلايا الجذعية غير المتمايزة أو للحث على تمايز أنواع الخلايا الناضجة10. هذا يتناقض مع الجسم الحي ، حيث توجد الخلايا الجذعية وأنواع الخلايا المتمايزة الناضجة في وقت واحد ويتم توليدها / صيانتها باستمرار1. من ناحية أخرى ، لا تتطلب الكائنات العضوية المعوية للفأر ، والتي تزرع في مزيج أقل تعقيدا من عوامل النمو ، هذا التبديل في تكوين الوسائط ويمكنها الحفاظ على الخلايا الجذعية والخلايا المتمايزة في نفس سياق الوسائط 2,11. ومع ذلك ، فإن الاختلافات الرئيسية في أمعاء الفأر عند مقارنتها بالبشر يمكن أن تجعل عضويات الفئران نموذجا دون المستوى الأمثل في كثير من الحالات. بشكل عام ، تم إنشاء العديد من الكائنات العضوية المعوية من الثدييات الكبيرة ، بما في ذلك الخيول والخنازير والأغنام والأبقار والكلاب والقطط ، بنجاح في ظروف الاستزراع الأكثر توافقا مع الكائنات العضوية المعوية للفأر من ظروف زراعة الكائنات العضوية المعوية البشرية12. من المحتمل أن تعكس الاختلافات في ظروف عامل النمو بين الفئران والكائنات العضوية البشرية الاختلافات في تكوين الخلايا الجذعية المتخصصة والمتطلبات المختلفة لبقاء الخلايا الجذعية وانتشارها وصيانتها. لذلك ، هناك حاجة إلى نظام عضوي نموذجي يسهل الوصول إليه 1) يشبه إلى حد كبير تكوين الخلايا المعوية البشرية ، 2) يحتوي على خلايا جذعية ذات متطلبات عامل النمو مثل تلك الخاصة بالكائنات العضوية المعوية البشرية ، و 3) قادر على الحفاظ باستمرار على مقصورات غير متمايزة ومتباينة. من الناحية المثالية ، سيكون النظام من نموذج حيواني قبل سريري شائع الاستخدام ، بحيث يمكن ربط التجارب في الجسم الحي وفي المختبر واستخدامها جنبا إلى جنب.
الفئران هي نموذج ما قبل السريري شائع الاستخدام لفسيولوجيا الأمعاء ودراسات علم الأدوية بسبب تشابهها الشديد في فسيولوجيا الأمعاء والكيمياء الحيوية للبشر13 ، خاصة فيما يتعلق بنفاذية الأمعاء14. حجمها الأكبر نسبيا مقارنة بالفئران يجعلها أكثر قابلية للعمليات الجراحية. في حين أن النماذج الحيوانية الكبيرة ، بما في ذلك الخنازير ، تستخدم في بعض الأحيان ، فإن الفئران هي نموذج أكثر بأسعار معقولة ، وتتطلب مساحة أقل للتربية ، ولديها سلالات قياسية متاحة تجاريابسهولة 15. عيب استخدام نماذج الفئران هو أن مجموعة الأدوات الجينية للدراسات في الجسم الحي ليست متطورة بشكل جيد مقارنة بالفئران ، وغالبا ما يكون توليد سلالات الفئران الجديدة ، بما في ذلك الضربة القاضية ، والضربات القاضية ، والجينات المحورة ، باهظ التكلفة. إن تطوير وتحسين نموذج عضوي قوي لأمعاء الفئران من شأنه أن يسمح بالتلاعب الجيني والعلاجات الدوائية ودراسات الإنتاجية الأعلى في نموذج يمكن الوصول إليه يحتفظ بالأهمية الفسيولوجية الرئيسية للبشر. ومع ذلك ، فإن مزايا نموذج عضوي للقوارض مقابل آخر تعتمد بشكل كبير على العملية أو الجين المعين قيد الدراسة. قد تكون بعض الجينات الموجودة في البشر جينات زائفة في الفئران ولكن ليس الفئران16,17. بالإضافة إلى ذلك ، يتم الكشف بشكل متزايد عن أنواع فرعية من الخلايا الخاصة بالأنواع بواسطة RNAseqأحادي الخلية 18،19،20. أخيرا ، غالبا ما تظهر نماذج الأمراض المعوية للفئران والفئران اختلافات كبيرة في الأنماط الظاهرية21,22 بحيث يجب اختيار النموذج الذي يلخص الأعراض وعملية المرض التي تظهر في البشر عن كثب للعمل النهائي. يوفر إنشاء نموذج عضوي معوي للفئران مرونة واختيارا إضافيا للباحثين في اختيار نظام نموذجي أكثر ملاءمة لظروفهم. هنا ، يتم توسيع البروتوكولات الحالية23،24 لتوليد عضويات معوية للفئران ويتم تحديد بروتوكول لتوليد وصيانة الكائنات العضوية المعوية للفئران من الاثني عشر أو الصائم. بالإضافة إلى ذلك ، تم وصف العديد من التطبيقات النهائية ، بما في ذلك العدوى الفيروسية العدسية ، وتلطيخ جبل كامل ، ومقايسات تورم فورسكولين.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-D Culture Matrix Rat Collagen I</td>
			<td>Cultrex/R&#38;D Systems</td>
			<td>3447-020-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2942-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>100-1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex HA-Rspondin1-Fc 293T cells</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Molecular Probes/Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher</td>
			<td>16-000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin I (human)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>100-0485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factor-reduced Matrigel, phenol red-free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB06021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lanolin</td>
			<td>Beantown Chemical</td>
			<td>144255-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Wnt3a cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P31-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td>transparent film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLJM1-EGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>19319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine hydrochloride (PEI)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>764965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-phenylenediamine&#160;</td>
			<td>Acros Organics/Thermo Fisher</td>
			<td>417481000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>J593-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF2 protein</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B-250ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IGF-1 protein</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>B356441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Noggin protein</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>6057-NG-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse EGF protein</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PMG8041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague Dawley rat</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td>Strain 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB02025-00500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 dihydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and manipulation of rat intestinal organoids

عند استخدام المواد العضوية لتقييم قرارات علم وظائف الأعضاء ومصير الخلية ، من المهم استخدام نموذج يلخص عن كثب في سياقات الجسم الحي . وفقا لذلك ، يتم استخدام المواد العضوية المشتقة من المريض لنمذجة الأمراض واكتشاف الأدوية وفحص العلاج الشخصي. تستخدم عضويات الأمعاء في الفئران بشكل شائع لفهم جوانب كل من وظيفة الأمعاء / علم وظائف الأعضاء وديناميكيات الخلايا الجذعية / قرارات المصير. ومع ذلك ، في العديد من سياقات المرض ، غالبا ما تفضل الفئران على الفئران كنموذج بسبب تشابهها الفسيولوجي الأكبر مع البشر من حيث الفيزيولوجيا المرضية للمرض. كان نموذج الفئران محدودا بسبب نقص الأدوات الوراثية المتاحة في الجسم الحي ، وقد أثبتت الكائنات العضوية المعوية للفئران أنها هشة ويصعب استزراعها على المدى الطويل. هنا ، نبني على البروتوكولات المنشورة مسبقا لتوليد عضويات معوية للفئران بقوة من الاثني عشر والصائم. نحن نقدم لمحة عامة عن العديد من التطبيقات النهائية التي تستخدم عضويات معوية للفئران ، بما في ذلك مقايسات التورم الوظيفي ، وتلطيخ جبل كامل ، وتوليد أحاديات الطبقة المعوية 2D ، ونقل lentiviral . يوفر نموذج الفئران العضوي حلا عمليا لحاجة الحقل إلى نموذج في المختبر يحتفظ بالأهمية الفسيولوجية للبشر ، ويمكن التلاعب به وراثيا بسرعة ، ويمكن الحصول عليه بسهولة دون الحواجز التي ينطوي عليها شراء عضويات معوية بشرية.

The human small intestinal epithelial architecture and cellular composition are complex, reflecting their physiological functions. The primary role of the small intestine is to absorb nutrients from food passing through its lumen1. To maximize this function, the intestinal surface is organized into finger-like protrusions called villi, which increase the absorptive surface area, and cup-like invaginations called crypts, which house and insulate the stem cells. Within the epithelium, various specialized absorptive and secretory cell types are generated to perform distinct functions1. Because of this complexity, it has been difficult to model tissues like the intestine in high passage-transformed immortalized cell lines. However, the study of stem cells, especially adult stem cells and their differentiation mechanisms, has allowed for the development of 3D intestinal organoid cultures. The use of organoid models has transformed the field, in part due to their recapitulation of some architectural components and cell type heterogeneity found in the intact intestine. Intestinal organoids can be cultured long-term in vitro due to the maintenance of the active stem cell population2.
Intestinal organoids have rapidly become an adaptable model to study stem cell biology, cell physiology, genetic disease, and nutrition3,4, as well as a tool to develop novel drug delivery methods5. In addition, patient-derived organoids are being utilized for disease modeling, drug discovery, and personalized treatment screening, among others6,7,8,9. However, human intestinal organoids still present challenges. Tissue availability, requirements for Institutional Review Board approval, and ethical issues limit the widespread use of human samples. Additionally, human intestinal organoids generated from intestinal crypts require two distinct culture conditions for the maintenance of undifferentiated stem cells or to induce the differentiation of mature cell types10. This contrasts with in vivo, where stem cells and mature differentiated cell types are simultaneously present and continuously generated/maintained1. On the other hand, mouse intestinal organoids, which are grown in a less complex cocktail of growth factors, do not require this switch in media composition and can maintain stem cells and differentiated cells in the same media context2,11. However, key differences in mouse intestine when compared to humans can make mouse organoids a suboptimal model in many instances. Overall, many intestinal organoids from larger mammals, including horses, pigs, sheep, cows, dogs, and cats, have been successfully generated in culture conditions more closely aligned with mouse intestinal organoids than the culture conditions of human intestinal organoids12. The differences in growth factor conditions between mouse and human organoids likely reflect differences in stem cell niche composition and differing requirements for stem cell survival, proliferation, and maintenance. Therefore, there is a need for an easily accessible model organoid system that 1) closely resembles human intestinal cell composition, 2) contains stem cells with growth factor requirements like those of human intestinal organoids, and 3) is capable of continuously maintaining undifferentiated and differentiated compartments. Ideally, the system would be from a commonly used preclinical animal model, such that in vivo and in vitro experiments can be correlated and used in tandem.
Rats are a commonly used preclinical model for intestinal physiology and pharmacology studies due to their very similar intestinal physiology and biochemistry to humans13, particularly with regards to intestinal permeability14. Their relatively larger size compared to mice makes them more amenable to surgical procedures. While large animal models, including pigs, are sometimes used, rats are a more affordable model, require less space for husbandry, and have readily commercially available standard strains15. A drawback of using rat models is that the genetic toolkit for in vivo studies is not well developed compared to mice, and the generation of novel rat lines, including knockouts, knock-ins, and transgenics, is often cost-prohibitive. The development and optimization of a robust rat intestinal organoid model would allow for genetic manipulation, pharmacological treatments, and higher throughput studies in an accessible model that retains key physiological relevance to humans. However, the advantages of one rodent organoid model versus another is highly dependent on the particular process or gene being studied; certain genes found in humans may be pseudogenes in mice but not rats16,17. Additionally, species-specific cell subtypes are increasingly being unveiled by single-cell RNAseq18,19,20. Finally, rat and mouse intestinal disease models often display considerable variations in phenotypes21,22 such that the model that more closely recapitulates the symptoms and disease process seen in humans must be selected for downstream work. The generation of a rat intestinal organoid model provides additional flexibility and choice for researchers in selecting a model system most appropriate for their circumstances. Here, existing protocols23,24 are expanded upon for the generation of rat intestinal organoids and a protocol is outlined for the generation and maintenance of rat intestinal organoids from the duodenum or jejunum. In addition, several downstream applications, including lentiviral infection, whole mount staining, and forskolin swelling assays, are described.

تسليط الضوء على المؤلف: توليد والتلاعب من العضويات المعوية الفئران  

توليد والتلاعب من العضويات المعوية الفئران

In this study we established a rat intestinal organoid model that is robust in long-term cell culture. We also demonstrate the first successful genetic manipulations using both lentiviral infection and transient transfection. This model is an excellent tool for manipulating intestinal biology in the rat where the genetic tools available in vivo are limited.Rat intestinal organoids have previously been difficult to culture long-term. By generating a robust, genetically-manipulatable rat organoid model, we are providing researchers additional flexibility and choice to select an organoid model best suited for their particular circumstances. Mouse intestinal organoids are used to study stem cell behavior, cell fate and physiology, but they can be a suboptimal model.Since there are key differences between mouse and human biology. On the other hand, human intestinal organoids can be difficult to obtain, and have complex cell culture requirements. The rat organoid model we describe here retains key physiological relevance to human biology, while being considerably easier to access and care for than human intestinal organoids.Developing and optimizing the rat intestinal organoid model allows for genetic manipulation, pharmacological treatments, and higher throughput studies of intestinal biology and accessible model with key physiological relevance to humans. Additionally, these rat organoids will allow for the study of species-specific physiology, cell fates, and phenotypic variations and disease models in the intestine.

تم إنشاء عضويات الاثني عشر والصائم للفئران باستخدام البروتوكول المبين في القسم 2. من المهم جدا أثناء خطوات عزل القبو أن يتم استنفاد الزغابات بكفاءة من PBS. إذا تم طلاء الكثير من الزغب في EME بالخبايا ، فقد يتسبب ذلك في موت الثقافة بأكملها والفشل في إنشاء خط عضوي. لهذا السبب ، من المفيد عزل الخبايا تحت نطاق تشريح ، مما يسمح بتأكيد مرئي لنضوب الشرير. يصور الشكل 1 شظايا وخبايا فيلار تمثيلية (الشكل 1 أ). لاحظ الحجم الأصغر بكثير للخبايا مقارنة بالزغابات (الشكل 1 ب). بعد الطلاء ، ستتوسع الخبايا إلى كرويات خلال الأيام القليلة القادمة وستبدأ في التبرعم والتمايز بحلول اليوم 4-7 (الشكل 2). بمجرد أن تصل المواد العضوية إلى مرحلة مهدة على نطاق واسع ، يجب تمريرها. أثناء المرور ، من المهم تعطيل المواد العضوية بما يكفي لتقسيم براعم القبو ، بحيث يمكن توسيع أعداد الأعضاء (الشكل 3 ب).
يعتمد الاسترداد الناجح للعضويات بعد التجميد بشكل كبير على الحالة التي يتم تجميدها فيها. تتعافى المواد العضوية في حالة غير متمايزة تكاثرية للغاية بأعلى كفاءة. لذلك ، نوصي بحثها على أن تكون كروية وكيسية بدلا من مهدها ومتباينة. لتحقيق ذلك ، يمكن تنشيط Wnt بشكل مفرط عن طريق زيادة كمية Wnt ligand R-spondin في الوسائط وعن طريق تضمين نيكوتيناميد في الوسائط ، والذي ثبت أنه يدعم تكوين الأعضاء وبقاء الخلايا في العديد من أنظمة الاستزراع30,31. يوضح الشكل 3 أ ثقافة عضوية صحية بعد يومين فقط من الذوبان. ساعد تضمين BSA في وسائل الإعلام أثناء ذوبان الجليد أيضا في بقاء الثقافات العضوية المعوية للفئران ، والتي أثبتت أنها أكثر حساسية من الكائنات العضوية المعوية للفئران.
في حين أن ثقافة 3D العضوية غالبا ما تكون مفضلة لأنها تلخص بعض البنية المعوية الطبيعية ، إلا أنها تجعل الأساليب الأخرى ، بما في ذلك التصوير الحي ، والنقل ، وعمليات النقل الفيروسية ، أكثر تحديا من الناحية الفنية. يسمح استخدام أحاديات الطبقات ثنائية الأبعاد المتولدة من المواد العضوية ثلاثية الأبعاد32 (الشكل 4) بإدخال البلازميدات بكفاءة أعلى. في حين أن المواد العضوية المعوية 3D مقاومة تقليديا لعمليات النقل العابرة ، يمكن إدخال ترميز البلازميدات ل EGFP بنجاح باستخدام طرق النقل القائمة على الدهون. تم تحديد النهج الأكثر فعالية من حيث التكلفة باستخدام PEI في الخطوة 6.1 (الشكل 5) ، ولكن التثقيب الكهربائي وكواشف النقل المتاحة تجاريا أسفرت أيضا عن نتائج قابلة للمقارنة (البيانات غير معروضة). ستركز الدراسات المستقبلية على ما إذا كان يمكن استخدام هذه الأساليب لإدخال تركيبات كريسبر في طبقة أحادية.
كان من المهم أن تكون قادرا على إصلاح المواد العضوية ثلاثية الأبعاد من أحاديات الطبقات 2D بعد النقل بحيث يمكن الحفاظ عليها كخط قابل للمرور مع المكونات المعمارية ثلاثية الأبعاد للأقبايا. ومن المثير للاهتمام ، أن أحاديات الطبقات 2D المطلية على EME تم إصلاحها بسهولة إلى كرويات صغيرة عندما تمت إضافة EME مرة أخرى إلى الجزء العلوي من الخلايا ، في حين أن ركيزة الكولاجين I لم تكن كافية لإصلاح هياكل 3D (الشكل 6).
في حين أن عمليات النقل العابرة مفيدة للعديد من الدراسات ، فإن تكوين خطوط مستقرة غالبا ما يكون أكثر فائدة ، مما يتطلب إدخال فيروس lentivirus في الخلايا. أصيبت عضويات معوية الفئران بفيروس lentivirus عن طريق تعديل البروتوكولات المنشورة سابقا (الشكل 7). الخطوة الرئيسية في البروتوكول هي تعطيل المواد العضوية إلى مجاميع صغيرة أو مجموعات خلوية. إذا لم يتم تعطيل الثقافات بكفاءة وظلت الكائنات العضوية سليمة ، فلن تدخل جزيئات الفيروسات العدسية إلى الخلايا. بعد الإصابة ، يجب أن تتعافى الكائنات العضوية وتنمو. يسمح البروتوكول الموضح هنا بامتصاص الجسيمات الفيروسية بنسبة 10٪ -48٪ (يعني: 19.4٪ ± 6.5٪) من الخلايا قبل الاختيار.
يمكن أن يكون تلطيخ الجسم الكامل للعضويات أمرا صعبا بسبب الإزالة غير الكاملة لبقايا EME أو اختراق الأجسام المضادة غير الكامل. يسمح البروتوكول الموضح هنا بتلطيخ قوي للمواد العضوية. يمكن أن يكون تصور المواد العضوية على المجهر متحد البؤر صعبا أيضا إذا كانت بعيدة جدا عن غطاء الغطاء. باستخدام VALAP ، يتم إنشاء بئر مع بعض الارتفاع بحيث لا يتم سحق المواد العضوية بواسطة غطاء الغطاء ، ولكن لا يزال يسمح لها بالاستقرار بالقرب من غطاء الغطاء لسهولة التصوير. يوضح الشكل 8 تلطيخا تمثيليا ضد منظم التوصيل عبر الغشاء للتليف الكيسي لقناة الأنيون القمية (CFTR) والقضيب لتسمية F-actin.
أخيرا ، المواد العضوية لها فائدة في المقايسات الوظيفية. تم استخدام المواد العضوية المشتقة من المريض من مرضى التليف الكيسي لفحص وظيفة CFTR ، حيث أن العلاج باستخدام فورسكولين ناهض cAMP يؤدي إلى إفراز سائل قوي بوساطة CFTR ، مما يسبب تورم عضوي29،33-37. كان أحد أهداف هذا العمل هو تحديد وتطوير نموذج عضوي يمكن استخدامه بالتوازي مع الدراسات قبل السريرية في الجسم الحي. لذلك ، كنا نهدف إلى تحديد ما إذا كانت الكائنات العضوية المعوية للفئران تخضع للتورم الناجم عن فورسكولين. في الواقع ، في غضون 30 دقيقة من علاج فورسكولين ، تضخمت عضويات الفئران ، مع تأثير أقصى لوحظ لمدة 120 دقيقة (الشكل 9).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig01.jpg"> الشكل 1: شظايا فيلار وخباياها أثناء العزل الطلائي . (أ) صورة تمثيلية لشظايا فيلار في محلول EDTA أثناء بروتوكول عزل التشفير. رؤوس الأسهم الصفراء علامة شظايا فيلار. تصور الأسهم الحمراء خبايا متصلة بجزء من الشرير. لاحظ الفرق في الأحجام النسبية. (ب) صورة تكبير أعلى لسرداب واحد (سهم أحمر) بحيث يمكن تصور التشكل. قضبان المقياس: 100 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig02.jpg"> الشكل 2: تطور العضو العضوي المعوي للفئران. تم طلاء خبايا الصائم الفئران في EME مباشرة بعد العزل (A ، B). في غضون 2 أيام ، أصبحت الخبايا كروية (C ، D). بحلول اليوم 5 ، بدأوا في بدء براعم التشفير (E ، F) ، والتي تطورت ونمت بحلول اليوم 7 (G). قضبان المقياس: 100 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig03.jpg"> الشكل 3: العضويات بعد الذوبان والتمرير. (أ) تم إذابة عضويات الفئران الصائمية باتباع البروتوكولات الموضحة بعد الحفظ بالتبريد. لاحظ وجود كل من الكائنات الكروية والعضوية البراعم بعد 2 أيام فقط من ذوبان الجليد. (ب) نفس الخط العضوي الموضح في A مباشرة بعد المرور باتباع البروتوكول المحدد. لاحظ فرق الحجم النسبي بين الهياكل في A و B ووجود مجالات واحدة تشبه التشفير في B. قضبان المقياس: 100 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig04.jpg"> الشكل 4: تشكيل أحادي الطبقة 2D من المواد العضوية ثلاثية الأبعاد. (A-C) تقدم أحادي الطبقة 2D على EME. (D-F) تقدم أحادي الطبقة 2D على الكولاجين I. بحلول اليوم 5 ، أسفرت كل حالة ~ 80٪ التقاء. قضبان المقياس: 100 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig05.jpg"> الشكل 5: الانتقال العابر لطبقة أحادية 2D. صورة تمثيلية لطبقة أحادية ثنائية الأبعاد نمت على EME تم نقلها بشكل عابر باستخدام بلازميد pLJM1-EGFP باستخدام PEI. (أ) برايتفيلد، (ب) التألق (GFP)، (ج) التراكب. يشير الخط الأحمر المنقط إلى حد الطبقة الأحادية. قضبان المقياس: 100 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig06.jpg"> الشكل 6: إصلاح المواد العضوية ثلاثية الأبعاد من أحاديات الطبقات ثنائية الأبعاد على EME. (أ) تكوين عضويات ثلاثية الأبعاد من طبقات أحادية ثنائية الأبعاد نمت في EME. تتشكل المواد العضوية بكفاءة بعد 5 أيام من إضافة EME إلى السطح القمي للطبقة الأحادية. لاحظ وفرة الخلايا الميتة المحيطة كرويات 3D الصغيرة. (ب) استمرار أحادي الطبقات ثنائي الأبعاد بعد 5 أيام من إضافة الكولاجين I إلى السطح القمي للطبقات الأحادية ثنائية الأبعاد المزروعة على الكولاجين I. قضبان المقياس: 100 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig06large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig07.jpg"> الشكل 7: عدوى Lentiviral من المواد العضوية 3D. أصيبت عضويات الفئران الصائمية بجزيئات GFP النووية عدسية باستخدام البروتوكول المحدد. بعد الشفاء والنمو لمدة 5 أيام ، تم إصلاح المواد العضوية وتلطيخها باستخدام DAPI. (أ) DAPI: رمادي؛ GFP النووية: أخضر. (ب) GFP النووية: أخضر. يشير الخط الأحمر المنقط إلى الحدود العضوية. قضبان المقياس: 50 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig07large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig08.jpg"> الشكل 8: التألق المناعي الكامل للعضويات المعوية للفئران. (أ) CFTR ، (ب) القضيب ، و (ج) دمج التألق المناعي الكامل للعضويات الصائمية للفئران. لاحظ الإثراء القمي لتلطيخ CFTR في المواد العضوية (الرمادي في A ، الأرجواني في C). يشير Phalloidin إلى F- actin ويسمي بشكل بارز حدود الفرشاة القمية (رمادي في B ، سماوي في C). قضبان المقياس: 25 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig08large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig09.jpg"> الشكل 9: تنتفخ عضويات معوية الفئران عند تحفيز فورسكولين. دورة زمنية تمثيلية لتورم عضوي معوي للفئران بعد إضافة فورسكولين ناهض cAMP. يمثل الوقت 0 دقيقة النقطة الزمنية مباشرة قبل إضافة 10 ميكرومتر فورسكولين. تظهر الصور نفس العضو العضوي على فترات زمنية 30 دقيقة. لوحظ أقصى تورم في 120 دقيقة بعد إضافة فورسكولين. يحدد الخط الأحمر المنقط الحدود العضوية. تتكون المادة المظلمة في منتصف التجويف العضوي من خلايا ميتة. قضبان المقياس: 100 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig09large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
الجدول 1: وصفة AdDMEM +. المكونات اللازمة لجعل وسائط AdDMEM + القياسية ، وهي الوسائط الأساسية عبر الطرق الموضحة هنا. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/Table1_Re.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.</a>
الجدول 2: وصفة الوسائط العضوية المعوية للفئران (rIOM). وصفة مفصلة للوسائط العضوية المعوية القياسية للفئران ، بما في ذلك ظروف المذيبات والتخزين للبروتينات المؤتلفة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/Table2_RE.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.</a>
الجدول 3: الحلول. وصفات وتعليمات لعمل حلول أخرى مستخدمة في جميع أنحاء البروتوكول. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/Table3_resub2_Re.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.</a>
الجدول 4. وسط عضوي معوي للفئران لثقافة أحادية الطبقة ثنائية الأبعاد (rIOM2D). وصفة معدلة من وسائط الثقافة العضوية الأمثل للنمو 2D من أحادي الطبقات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/Table4_resub2_RE.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Manipulation of Rat Intestinal Organoids at JoVE.com

هنا ، نقدم بروتوكولا لتوليد عضويات معوية للفئران واستخدامها في العديد من التطبيقات النهائية. غالبا ما تكون الفئران نموذجا مفضلا قبل السريري ، ويملأ النظام العضوي المعوي القوي الحاجة إلى نظام في المختبر لمرافقة الدراسات في الجسم الحي .

When using organoids to assess physiology and cell fate decisions, it is important to use a model that closely recapitulates in vivo contexts. ...

في هذه الدراسة أنشأنا نموذجا عضويا معويا للفئران قويا في زراعة الخلايا على المدى الطويل. كما نعرض أول معالجات جينية ناجحة باستخدام كل من العدوى الفيروسية العدسية والنقل العابر. هذا النموذج هو أداة ممتازة لمعالجة البيولوجيا المعوية في الفئران حيث الأدوات الوراثية المتاحة في الجسم الحي محدودة.كان من الصعب في السابق زراعة العضويات المعوية للفئران على المدى الطويل. من خلال إنشاء نموذج عضوي قوي وقابل للتلاعب وراثيا ، فإننا نوفر للباحثين مرونة إضافية وخيارا لاختيار نموذج عضوي يناسب ظروفهم الخاصة. تستخدم الكائنات العضوية المعوية للفأر لدراسة سلوك الخلايا الجذعية ومصير الخلية وعلم وظائف الأعضاء ، ولكنها يمكن أن تكون نموذجا دون المستوى الأمثل.نظرا لوجود اختلافات رئيسية بين الفأر والبيولوجيا البشرية. من ناحية أخرى ، قد يكون من الصعب الحصول على عضويات معوية بشرية ، ولها متطلبات معقدة لزراعة الخلايا. يحتفظ نموذج الفئران العضوي الذي وصفناه هنا بالأهمية الفسيولوجية الرئيسية لعلم الأحياء البشري ، بينما يسهل الوصول إليه والعناية به أكثر من الكائنات العضوية المعوية البشرية.يسمح تطوير وتحسين نموذج العضو العضوي المعوي للفئران بالتلاعب الجيني والعلاجات الدوائية ودراسات الإنتاجية الأعلى لبيولوجيا الأمعاء والنموذج الذي يمكن الوصول إليه مع الصلة الفسيولوجية الرئيسية للبشر. بالإضافة إلى ذلك ، ستسمح هذه الكائنات العضوية للفئران بدراسة علم وظائف الأعضاء الخاص بالأنواع ، ومصير الخلايا ، والاختلافات الظاهرية ونماذج المرض في الأمعاء.

توليد والتلاعب من العضويات المعوية الفئران

Abstract