Sumigray ve Ameen laboratuvarlarının üyelerine düşünceli tartışmaları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Charles H. Hood Vakfı Çocuk Sağlığı Hibesi ve Kistik Fibrozis Vakfı hibesi (004741P222) tarafından KS'ye ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü tarafından 2R01DK077065-12 ödül numarası altında NA'ya desteklenmiştir.

Sıçan Bağırsak Kriptleri İzolasyonu ve Bağırsak Organoidleri Üretimi

Bir sıçan bağırsak organoid modelinin geliştirilmesi, in vivo organda bulunan önemli fonksiyonel özellikleri korur ve klinik öncesi testler, ilaç taraması ve fonksiyonel tahliller için umut verici bir araçtır. Bu in vitro model, daha büyük bağırsak boyutları, insanlarla paylaşılan fizyolojik yönleri ve bazı durumlarda daha iyi hastalık modelleri olmaları nedeniyle sıçanların sıklıkla tercih edilen bir model olduğu in vivo klinik öncesi gastroenteroloji çalışmalarına paralel olarak kullanılabilir38. Burada, sıçan bağırsak kriptlerinin izolasyonu, sıçan bağırsak organoidlerinin üretimi ve uzun süreli kültürünün yanı sıra fonksiyonel forskolin şişme deneyleri, tüm montaj immünofloresansı, 2D tek tabakalı kültür ve lentiviral genetik manipülasyon dahil olmak üzere aşağı akış uygulamaları için sağlam bir adım adım protokol özetlenmiştir. Sıçan bağırsak organoidlerinin, fare modellerinin patofizyolojisinin uygun olmadığı birçok hastalık bağlamında ilgili olması muhtemeldir ve fare bağırsak organoidlerine kıyasla insan bağırsak fizyolojisi için daha iyi bir model sağlayabilir.
Geçilebilen ve genişletilebilen uzun ömürlü organoid kültürler oluşturmak için, bağırsak epitelyal proliferasyonunu sürdürmek için gerekli olan temel büyüme faktörlerini belirlemek esastır. Fare organoidleri çoğunlukla EGF, R-spondin ve Noggin'in basit bir kokteylinde yetiştirilir, ancak Noggin'in bağırsak organoid kültürü için gerekli olmadığı bildirilmiştir39. Şartlandırılmış ortam, rekombinant büyüme faktörlerinin yerini alabilir ve en yaygın kullanılan hücre hatları, Wnt3a, Rspondin-3 ve Noggin39, L-Wnt3a ve HA-Rspondin1-Fc 293T hücrelerini40 salgılayan L-WRN'dir. L-WRN koşullu ortam, yalnızca fare bağırsağı39 organoid büyümesini değil, aynı zamanda köpekler, kediler, tavuklar, atlar, inekler, koyunlar ve domuzlar dahil olmak üzere çeşitli çiftlik hayvanlarından ve refakatçi hayvanlardan bağırsak organoidlerinin büyümesini desteklemek için yeterlidir12. Bununla birlikte, insan bağırsak organoidleri, genişleme büyüme fazları (yani, küçükten büyük sferoidlere ilerleme) ve farklılaşma fazları (yani, farklılaşmış hücre tiplerinin üretimi ve olgunlaşması) için farklı ortam formülasyonları gerektirdiğinden, büyüme faktörü gereksinimlerinde çok farklıdır10. Sıçan bağırsak organoidlerinin ortam gereksinimleri, insan bağırsak organoidleri için genişleme büyüme ortamınınkileri yakından yansıtır, ancak özellikle sıçan organoidleri, bu ortam ortamında hem büyüme hem de farklılaşma yeteneğine sahiptir ve kültür gereksinimlerini önemli ölçüde basitleştirir. İlk girişimlerimiz L-WRN ile koşullandırılmış ortamda sıçan bağırsak organoidlerinin kurulmasına ve büyütülmesine odaklanırken, uzun süreli kültür zayıftı ve sıçan bağırsak organoid hatları sağlamlık eksikliğinden muzdaripti (veriler gösterilmemiştir). Bunun nedeni, L-WRN hücre hatlarının R-spondin 3'ü salgılamak üzere tasarlanmış olması, burada önerilen 293T-Rspo1 hücre hattının ise R-spondin 1'i salgılamak üzere tasarlanmış olması olabilir. Sıçan ve insan organoidlerinin R-spondin 1'i tercih etmesi mümkündür, bu da potansiyel olarak L-WRN şartlandırılmış ortamdaki sıçan organoid hatlarının başarısızlığını açıklar.
İn vivo ortamı en yakından özetlemek gerekirse, kök hücrenin hayatta kalmasına, sürdürülmesine ve çoğalmasına izin veren ve hücresel döngüyü ve eşzamanlı farklılaşma olaylarını ayrı hücre tiplerine koruyabilen organoid kültür koşullarının geliştirilmesi önemlidir. Bu nedenle, şartlandırılmış ortamdaki rekombinant proteinlerin ve/veya proteinlerin konsantrasyonlarının, bu mükemmel dengeyi sağlamak için sıkı bir şekilde titre edilmesi ve kontrol edilmesi gerekir. Özellikle, bağırsak organoid kültürlerinin kaybını önlemek için optimal Wnt seviyeleri gereklidir. Şartlandırılmış ortamda çok az Wnt, büyümeyi destekleyemeyecek, kök hücre kaybına ve ardından organoid ölüme yol açacaktır; Wnt'nin aşırı aktivasyonu, organoidlerin kistik ve farklılaşmamış olmasına neden olur10. Burada ayrıntılı olarak açıklanmamakla birlikte, her bir L-Wnt3a ve 293T-Rspo1 koşullu ortam partisinin, bir Topflash hücre hattı41 gibi bir Wnt muhabir lusiferaz testi kullanılarak test edilmesi şiddetle tavsiye edilir. Önceki çalışmalar, optimal bir L-Wnt3a ortamı partisinin, %1 L-Wnt3a 10'a kıyasla, %12,5'te15 kat sinyal artışı ve %50'de 300 kat sinyal artışı ile sonuçlanması gerektiğini açıklamıştır. Sıçan organoidleri, kültür gereksinimlerine, özellikle Wnt aktivasyon seviyelerine fare organoidlerinden daha duyarlı olduğundan, bu ek kalite kontrol adımları, sıçan organoid kültürlerinin sağlamlığını ve güvenilirliğini kolaylaştırmaya büyük ölçüde yardımcı olur. Noggin şartlandırılmış ortamda Bmp aktivitesini ve nispi Noggin konsantrasyonlarını test etmek için benzer bir raportör hattı mevcut olmadığından, Noggin seviyelerini hassas bir şekilde kontrol etmek için mümkün olduğunda rekombinant Noggin kullanılması tavsiye edilir. Fare bağırsak organoidleri Noggin39'un yokluğunda büyütülebilir ve korunabilirken, sıçan bağırsak organoid kültürleri için bu denenmemiştir.
Hücre kültürü gereksinimlerinin ötesinde, bir sıçan organoid hattının başarılı bir şekilde kurulması, kript izolasyonu sırasında farklılaşmış villusların verimli bir şekilde tükenmesine kritik olarak bağlıdır. Yüksek düzeyde villar kontaminasyon, muhtemelen ölmekte olan hücrelerden gelen sinyaller veya temel faktörlerin sekestrasyonu nedeniyle kript ölümüne neden olur. Bu farklılaşmış villusları epitelyal preparatlardan kesin ve tutarlı bir şekilde tüketmek için, bir stereoskop yardımıyla epitel izolasyonlarının yapılması önerilir. Serbest bırakılan epitelin görsel muayenesi, PBS'nin ne zaman atılacağı ve değiştirileceği konusunda net bir ipucu sağlar (Şekil 1). Yeterli villus tükeninceye kadar kriptler toplanmamalıdır. Villar hücreler terminal olarak farklılaşır ve kültürde organoid üretemezler. Ek olarak, sıçan bağırsak organoidlerinin daha sonra geçirilmesi ve bunların herhangi bir aşağı akış uygulaması için kullanılması hassas bakım gerektirir. Ayrışma reaktiflerinde daha uzun süre (10 dakika) inkübasyon, önemli hücre ölümüne ve organoid hattının kaybına neden olur.
Burada, sıçan organoidlerinden bağırsak tek katmanları oluşturmak için basit ve hızlı bir protokol açıklanmaktadır. EME ve kollajen I substratlarının epitel üzerinde farklı etkileri vardır ve bu etkilerden çalışmanın amacına bağlı olarak yararlanılabilir. EME, tek hücrelerin hızlı ve verimli bir şekilde yapışmasına ve hücre projeksiyonlarının oluşumuna izin verir. Buna karşılık, yüzeyin kollajen I ile kaplanması bu işlemleri geciktirir. Tek tabakalar yaklaşık% 80 birleşmeye ulaştığında, EME'de büyüyen hücreler tekrar 3D organoid yapılar üretmeye başlar. Bununla birlikte, sürekli büyüme için yeterli fiziksel ve kimyasal destekten yoksundurlar. Organoid duruma geri dönüş, EME'deki tek katmanları %50-80'lik bir birleşmede tutarak önlenebilir. Tek tabakaların apikal yüzeyine seyreltilmiş EME ilavesi, de novo organoidlerin hızlı bir şekilde geri kazanılmasını ve oluşumunu teşvik ederek daha hızlı ve kolay bir şekilde yakınsama bölgeleri oluşturur. Bir kollajen I yüzeyinde, hücreler tek tip bir tek tabaka oluşturabilir ve küçük kümeler oluşturabilir. Bununla birlikte, tek tabakaların üzerine kollajen I ilavesi, organoid oluşumunu indüklemek için yeterli değildir. Yeni ortaya çıkan organoidin üstesinden gelmesi için daha güçlü bir mekanik direnç olacağından, tek katmanlı yüzeye eklenirken EME seyreltilmelidir. Bununla birlikte, bu seyreltilmiş EME, büyük organoidlerin sağlam oluşumuna izin vermez. Yüzeyden doğal olarak ayrılan herhangi bir de novo tarafından üretilen sıçan organoidleri derhal çıkarılmalı ve seyreltilmemiş EME'ye aktarılmalıdır, böylece yapısal destek ve büyüme geri yüklenebilir. Bu adımdaki organoidlerin küçük boyutu nedeniyle, sağlam bir büyüme sağlanana kadar organoidlerin geçişi önerilmez. EME'nin neden organoidlerin reformasyonunu destekleyebildiğinin altında yatan biyolojik önem, ancak kollajen I'in bunu yapıp yapamayacağı açık değildir. Bununla birlikte, 3D kollajende yetiştirilen hücrelerin tomurcuklanmış organoidler42,43 oluşturamayacağına veya uzun süreli bakımı destekleyemediğine dair raporlar vardır. Ticari olarak temin edilebilen EME ürünleri, başta laminin ve kollajen IV44 olmak üzere hücre dışı proteinlerin heterojen karışımlarıdır. Bu nedenle, proteinlerin farklı bileşimi ve bir epitel hücresinin farklı hücresel kompleksler kullanarak hücre dışı matris ile etkileşime girme yeteneği, EME'de yeniden şekillenmeye izin verebilir, ancak kollajen I'de değil. Kollajen I'den türetilen tek katmanların organoid oluşumunu ve büyümesini desteklemek için EME'ye konulup konulamayacağı test edilmemiştir.
Sıçan bağırsak organoid modelinin genetik manipülasyonu burada açıklanmıştır ve 3D organoidlerin lentiviral transdüksiyonu ve 2D tek tabakaların geçici transfeksiyonu için protokoller özetlenmiştir. Lentiviral organoid transdüksiyonun düşük verimliliğinin üstesinden gelmek için, 2D tek tabakaların geçici transfeksiyonu için bir protokol geliştirilmiştir. Tek katmanların düz morfolojisi ve açıkta kalan apikal alanları, virüslere ve DNA içeren komplekslere daha kolay erişim sağlar. Bu tekniğin doğrulanması için pLJM1-EGFP vektörünü kullanan bir EGFP raportörünün ifadesi kullanıldı. GFP raportör ekspresyonu 24 saat sonra gözlendi ve tek tabakalarda 5-6 gün boyunca korundu. Tek tabakaların lentiviral transdüksiyonuna odaklanan gelecekteki çalışmaların, 3D organoid transdüksiyonundan daha yüksek verimliliğe sahip olması muhtemeldir. Yukarıdaki protokolleri kullanarak, kararlı çizgilerin oluşturulmasını kolaylaştırmak için enfekte olmuş 2D tek katmanlardan 3D organoidler yeniden oluşturulabilir. Dikkatli bir şekilde, sıçan bağırsak organoidleri hatları bir yıldan fazla bir süre boyunca başarılı bir şekilde korunabilir, birçok pasajda stabil kalabilir, dondurularak saklanabilir, başarılı bir şekilde çözülebilir ve lentiviral transdüksiyon kullanılarak genetik olarak modifiye edilebilir, böylece erişilebilir ve izlenebilir bir in vitro bağırsak organoid modeline olan ihtiyacı ele alır.

İnsan ince bağırsak epitel mimarisi ve hücresel bileşimi karmaşıktır ve fizyolojik işlevlerini yansıtır. İnce bağırsağın birincil rolü, lümeninden geçen gıdalardanbesinleri emmektir 1. Bu işlevi en üst düzeye çıkarmak için, bağırsak yüzeyi, emici yüzey alanını artıran villus adı verilen parmak benzeri çıkıntılar ve kök hücreleri barındıran ve izole eden kript adı verilen fincan benzeri istilalar halinde düzenlenir. Epitel içinde, farklı işlevleri yerine getirmek için çeşitli özel emici ve salgı hücre tipleri üretilir1. Bu karmaşıklık nedeniyle, bağırsak gibi dokuları yüksek pasajla dönüştürülmüş ölümsüzleştirilmiş hücre dizilerinde modellemek zor olmuştur. Bununla birlikte, kök hücrelerin, özellikle yetişkin kök hücrelerin ve bunların farklılaşma mekanizmalarının incelenmesi, 3D bağırsak organoid kültürlerinin geliştirilmesine izin vermiştir. Organoid modellerin kullanımı, kısmen bazı mimari bileşenlerin yeniden özetlenmesi ve sağlam bağırsakta bulunan hücre tipi heterojenliği nedeniyle alanı dönüştürmüştür. Bağırsak organoidleri, aktif kök hücre popülasyonunun korunması nedeniyle in vitro olarak uzun süreli kültürlenebilir2.
Bağırsak organoidleri, kök hücre biyolojisi, hücre fizyolojisi, genetik hastalık ve beslenmeyi incelemek için hızla uyarlanabilir bir modelhaline gelmiştir 3,4 ve ayrıca yeni ilaç dağıtım yöntemleri geliştirmek için bir araç5. Ek olarak, hastadan elde edilen organoidler, diğerlerinin yanı sıra hastalık modellemesi, ilaç keşfi ve kişiselleştirilmiş tedavi taraması için kullanılmaktadır 6,7,8,9. Bununla birlikte, insan bağırsak organoidleri hala zorluklar sunmaktadır. Doku mevcudiyeti, Kurumsal İnceleme Kurulu onayı için gereklilikler ve etik konular, insan örneklerinin yaygın kullanımını sınırlamaktadır. Ek olarak, bağırsak kriptlerinden üretilen insan bağırsak organoidleri, farklılaşmamış kök hücrelerin korunması veya olgun hücre tiplerinin farklılaşmasını indüklemek için iki farklı kültür koşulu gerektirir10. Bu, kök hücrelerin ve olgun farklılaşmış hücre tiplerinin aynı anda mevcut olduğu ve sürekli olarak üretildiği/sürdürüldüğü in vivo ile çelişir1. Öte yandan, daha az karmaşık bir büyüme faktörleri kokteyli içinde yetiştirilen fare bağırsak organoidleri, ortam bileşiminde bu geçişi gerektirmez ve kök hücreleri ve farklılaşmış hücreleri aynı ortam bağlamında koruyabilir 2,11. Bununla birlikte, insanlarla karşılaştırıldığında fare bağırsağındaki temel farklılıklar, fare organoidlerini birçok durumda optimal olmayan bir model haline getirebilir. Genel olarak, atlar, domuzlar, koyunlar, inekler, köpekler ve kediler dahil olmak üzere daha büyük memelilerden elde edilen birçok bağırsak organoidi, insan bağırsak organoidlerinin kültür koşullarından ziyade fare bağırsak organoidleri ile daha yakından hizalanmış kültür koşullarında başarılı bir şekilde üretilmiştir12. Fare ve insan organoidleri arasındaki büyüme faktörü koşullarındaki farklılıklar muhtemelen kök hücre niş bileşimindeki farklılıkları ve kök hücrenin hayatta kalması, çoğalması ve bakımı için farklı gereksinimleri yansıtmaktadır. Bu nedenle, 1) insan bağırsak hücre bileşimine çok benzeyen, 2) insan bağırsak organoidlerininki gibi büyüme faktörü gereksinimleri olan kök hücreler içeren ve 3) farklılaşmamış ve farklılaşmış bölmeleri sürekli olarak koruyabilen, kolay erişilebilir bir model organoid sisteme ihtiyaç vardır. İdeal olarak, sistem yaygın olarak kullanılan bir klinik öncesi hayvan modelinden olacaktır, öyle ki in vivo ve in vitro deneyler ilişkilendirilebilir ve birlikte kullanılabilir.
Sıçanlar, özellikle bağırsak geçirgenliği14 ile ilgili olarak, insanlara çok benzer bağırsak fizyolojisi ve biyokimyası nedeniyle bağırsak fizyolojisi ve farmakoloji çalışmaları için yaygın olarak kullanılan bir klinik öncesi modeldir13. Farelere kıyasla nispeten daha büyük boyutları, onları cerrahi prosedürlere daha uygun hale getirir. Bazen domuzlar da dahil olmak üzere büyük hayvan modelleri kullanılırken, sıçanlar daha uygun fiyatlı bir modeldir, hayvancılık için daha az alan gerektirir ve ticari olarak kolayca temin edilebilen standart suşlara sahiptir15. Sıçan modellerini kullanmanın bir dezavantajı, in vivo çalışmalar için genetik araç setinin farelere kıyasla iyi gelişmemiş olması ve nakavtlar, nakavtlar ve transgenikler dahil olmak üzere yeni sıçan hatlarının üretilmesinin genellikle maliyet engelleyici olmasıdır. Sağlam bir sıçan bağırsak organoid modelinin geliştirilmesi ve optimizasyonu, genetik manipülasyona, farmakolojik tedavilere ve insanlarla temel fizyolojik alaka düzeyini koruyan erişilebilir bir modelde daha yüksek verimli çalışmalara izin verecektir. Bununla birlikte, bir kemirgen organoid modelinin diğerine karşı avantajları, incelenen belirli sürece veya gene büyük ölçüde bağlıdır; İnsanlarda bulunan bazı genler farelerde psödogen olabilir, ancak sıçanlarda olmayabilir16,17. Ek olarak, türe özgü hücre alt tipleri, tek hücreli RNAseq18,19,20 tarafından giderek daha fazla ortaya çıkarılmaktadır. Son olarak, sıçan ve fare bağırsak hastalığı modelleri genellikle fenotiplerde önemli farklılıklar gösterir21,22, öyle ki, insanlarda görülen semptomları ve hastalık sürecini daha yakından özetleyen model, aşağı akış çalışması için seçilmelidir. Bir sıçan bağırsak organoid modelinin oluşturulması, araştırmacılara kendi koşullarına en uygun model sistemini seçmede ek esneklik ve seçenek sağlar. Burada, sıçan bağırsak organoidlerinin üretimi için mevcut protokoller23,24 genişletilmiştir ve duodenum veya jejunumdan sıçan bağırsak organoidlerinin üretimi ve bakımı için bir protokol özetlenmiştir. Ek olarak, lentiviral enfeksiyon, tüm mount boyama ve forskolin şişme testleri dahil olmak üzere çeşitli aşağı akış uygulamaları açıklanmaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-D Culture Matrix Rat Collagen I</td>
			<td>Cultrex/R&#38;D Systems</td>
			<td>3447-020-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2942-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>100-1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex HA-Rspondin1-Fc 293T cells</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Molecular Probes/Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher</td>
			<td>16-000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin I (human)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>100-0485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factor-reduced Matrigel, phenol red-free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB06021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lanolin</td>
			<td>Beantown Chemical</td>
			<td>144255-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Wnt3a cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P31-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td>transparent film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLJM1-EGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>19319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine hydrochloride (PEI)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>764965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-phenylenediamine&#160;</td>
			<td>Acros Organics/Thermo Fisher</td>
			<td>417481000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>J593-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF2 protein</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B-250ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IGF-1 protein</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>B356441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Noggin protein</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>6057-NG-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse EGF protein</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PMG8041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague Dawley rat</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td>Strain 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB02025-00500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 dihydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and manipulation of rat intestinal organoids

Fizyoloji ve hücre kaderi kararlarını değerlendirmek için organoidleri kullanırken, in vivo bağlamları yakından özetleyen bir model kullanmak önemlidir. Buna göre, hasta kaynaklı organoidler hastalık modellemesi, ilaç keşfi ve kişiselleştirilmiş tedavi taraması için kullanılır. Fare bağırsak organoidleri, hem bağırsak fonksiyonu/fizyolojisi hem de kök hücre dinamiği/kader kararlarının yönlerini anlamak için yaygın olarak kullanılır. Bununla birlikte, birçok hastalık bağlamında, sıçanlar, hastalık patofizyolojisi açısından insanlara daha fazla fizyolojik benzerlikleri nedeniyle bir model olarak farelere göre sıklıkla tercih edilir. Sıçan modeli, in vivo olarak mevcut olan genetik araçların eksikliği ile sınırlandırılmıştır ve sıçan bağırsak organoidlerinin kırılgan olduğu ve uzun vadede kültürlenmesinin zor olduğu kanıtlanmıştır. Burada, duodenum ve jejunumdan sağlam bir şekilde sıçan bağırsak organoidleri üretmek için daha önce yayınlanmış protokoller üzerine inşa ediyoruz. Fonksiyonel şişme deneyleri, tüm montaj boyama, 2D enteroid tek tabakaların oluşturulması ve lentiviral transdüksiyon dahil olmak üzere sıçan bağırsak organoidlerini kullanan çeşitli aşağı akış uygulamalarına genel bir bakış sunuyoruz. Sıçan organoid modeli, insanlarla fizyolojik alaka düzeyini koruyan, hızlı bir şekilde genetik olarak manipüle edilebilen ve insan bağırsak organoidlerinin tedarikinde yer alan engeller olmadan kolayca elde edilebilen bir in vitro model için alanın ihtiyacına pratik bir çözüm sunar.

The human small intestinal epithelial architecture and cellular composition are complex, reflecting their physiological functions. The primary role of the small intestine is to absorb nutrients from food passing through its lumen1. To maximize this function, the intestinal surface is organized into finger-like protrusions called villi, which increase the absorptive surface area, and cup-like invaginations called crypts, which house and insulate the stem cells. Within the epithelium, various specialized absorptive and secretory cell types are generated to perform distinct functions1. Because of this complexity, it has been difficult to model tissues like the intestine in high passage-transformed immortalized cell lines. However, the study of stem cells, especially adult stem cells and their differentiation mechanisms, has allowed for the development of 3D intestinal organoid cultures. The use of organoid models has transformed the field, in part due to their recapitulation of some architectural components and cell type heterogeneity found in the intact intestine. Intestinal organoids can be cultured long-term in vitro due to the maintenance of the active stem cell population2.
Intestinal organoids have rapidly become an adaptable model to study stem cell biology, cell physiology, genetic disease, and nutrition3,4, as well as a tool to develop novel drug delivery methods5. In addition, patient-derived organoids are being utilized for disease modeling, drug discovery, and personalized treatment screening, among others6,7,8,9. However, human intestinal organoids still present challenges. Tissue availability, requirements for Institutional Review Board approval, and ethical issues limit the widespread use of human samples. Additionally, human intestinal organoids generated from intestinal crypts require two distinct culture conditions for the maintenance of undifferentiated stem cells or to induce the differentiation of mature cell types10. This contrasts with in vivo, where stem cells and mature differentiated cell types are simultaneously present and continuously generated/maintained1. On the other hand, mouse intestinal organoids, which are grown in a less complex cocktail of growth factors, do not require this switch in media composition and can maintain stem cells and differentiated cells in the same media context2,11. However, key differences in mouse intestine when compared to humans can make mouse organoids a suboptimal model in many instances. Overall, many intestinal organoids from larger mammals, including horses, pigs, sheep, cows, dogs, and cats, have been successfully generated in culture conditions more closely aligned with mouse intestinal organoids than the culture conditions of human intestinal organoids12. The differences in growth factor conditions between mouse and human organoids likely reflect differences in stem cell niche composition and differing requirements for stem cell survival, proliferation, and maintenance. Therefore, there is a need for an easily accessible model organoid system that 1) closely resembles human intestinal cell composition, 2) contains stem cells with growth factor requirements like those of human intestinal organoids, and 3) is capable of continuously maintaining undifferentiated and differentiated compartments. Ideally, the system would be from a commonly used preclinical animal model, such that in vivo and in vitro experiments can be correlated and used in tandem.
Rats are a commonly used preclinical model for intestinal physiology and pharmacology studies due to their very similar intestinal physiology and biochemistry to humans13, particularly with regards to intestinal permeability14. Their relatively larger size compared to mice makes them more amenable to surgical procedures. While large animal models, including pigs, are sometimes used, rats are a more affordable model, require less space for husbandry, and have readily commercially available standard strains15. A drawback of using rat models is that the genetic toolkit for in vivo studies is not well developed compared to mice, and the generation of novel rat lines, including knockouts, knock-ins, and transgenics, is often cost-prohibitive. The development and optimization of a robust rat intestinal organoid model would allow for genetic manipulation, pharmacological treatments, and higher throughput studies in an accessible model that retains key physiological relevance to humans. However, the advantages of one rodent organoid model versus another is highly dependent on the particular process or gene being studied; certain genes found in humans may be pseudogenes in mice but not rats16,17. Additionally, species-specific cell subtypes are increasingly being unveiled by single-cell RNAseq18,19,20. Finally, rat and mouse intestinal disease models often display considerable variations in phenotypes21,22 such that the model that more closely recapitulates the symptoms and disease process seen in humans must be selected for downstream work. The generation of a rat intestinal organoid model provides additional flexibility and choice for researchers in selecting a model system most appropriate for their circumstances. Here, existing protocols23,24 are expanded upon for the generation of rat intestinal organoids and a protocol is outlined for the generation and maintenance of rat intestinal organoids from the duodenum or jejunum. In addition, several downstream applications, including lentiviral infection, whole mount staining, and forskolin swelling assays, are described.

Yazar Spotlight: Sıçan Bağırsak Organoidlerinin Üretimi ve Manipülasyonu  

Sıçan Bağırsak Organoidlerinin Üretimi ve Manipülasyonu

In this study we established a rat intestinal organoid model that is robust in long-term cell culture. We also demonstrate the first successful genetic manipulations using both lentiviral infection and transient transfection. This model is an excellent tool for manipulating intestinal biology in the rat where the genetic tools available in vivo are limited.Rat intestinal organoids have previously been difficult to culture long-term. By generating a robust, genetically-manipulatable rat organoid model, we are providing researchers additional flexibility and choice to select an organoid model best suited for their particular circumstances. Mouse intestinal organoids are used to study stem cell behavior, cell fate and physiology, but they can be a suboptimal model.Since there are key differences between mouse and human biology. On the other hand, human intestinal organoids can be difficult to obtain, and have complex cell culture requirements. The rat organoid model we describe here retains key physiological relevance to human biology, while being considerably easier to access and care for than human intestinal organoids.Developing and optimizing the rat intestinal organoid model allows for genetic manipulation, pharmacological treatments, and higher throughput studies of intestinal biology and accessible model with key physiological relevance to humans. Additionally, these rat organoids will allow for the study of species-specific physiology, cell fates, and phenotypic variations and disease models in the intestine.

Sıçan duodenal ve jejunal organoidleri, bölüm 2'de özetlenen protokol kullanılarak üretildi. Kript izolasyon adımları sırasında villusların PBS'den verimli bir şekilde tükenmesi çok önemlidir. EME'de kriptlerle çok fazla villus kaplanırsa, tüm kültürün ölümüne ve organoid bir hattın kurulamamasına neden olabilir. Bu nedenle, kriptleri bir diseksiyon kapsamı altında izole etmek yararlıdır, bu da villar tükenmesinin görsel olarak doğrulanmasına izin verir. Şekil 1 , temsili villar parçalarını ve kriptleri göstermektedir (Şekil 1A). Villuslara kıyasla önemli ölçüde daha küçük kript boyutuna dikkat edin (Şekil 1B). Kaplamadan sonra, kriptler önümüzdeki birkaç gün içinde sferoidlere genişleyecek ve 4-7. günlerde tomurcuklanmaya ve farklılaşmaya başlayacaktır (Şekil 2). Organoidler yoğun bir şekilde tomurcuklanmış bir aşamaya ulaştığında, geçilmeleri gerekir. Geçiş sırasında, organoid sayılarının genişletilebilmesi için organoidleri kript tomurcuklarını ayıracak kadar parçalamak önemlidir (Şekil 3B).
Dondurulduktan sonra organoidlerin başarılı bir şekilde geri kazanılması, büyük ölçüde donduruldukları duruma bağlıdır. Yüksek oranda çoğalan farklılaşmamış bir durumdaki organoidler en yüksek verimlilikle iyileşir. Bu nedenle, tomurcuklanmaları ve farklılaşmaları yerine küresel ve kistik olmalarını sağlamanızı öneririz. Bunu başarmak için, ortamdaki Wnt ligandı R-spondin miktarını artırarak ve çeşitli kültür sistemlerinde organoid oluşumunu ve hücre sağkalımını desteklediği gösterilen ortama nikotinamid dahil edilerek Wnt hiperaktive edilebilir30,31. Şekil 3A, çözülmeden sadece 2 gün sonra sağlıklı bir organoid kültürü göstermektedir. Çözdürme sırasında BSA'nın medyaya dahil edilmesi, fare bağırsak organoidlerinden daha hassas olduğu kanıtlanmış olan sıçan bağırsak organoid kültürlerinin hayatta kalmasına da yardımcı olmuştur.
3D organoid kültür, normal bağırsak mimarisinin bir kısmını özetlediği için sıklıkla tercih edilirken, canlı görüntüleme, transfeksiyonlar ve lentiviral transdüksiyonlar dahil olmak üzere diğer yaklaşımları teknik olarak daha zor hale getirir. 3D organoidlerden(Şekil 4) üretilen 2D tek katmanların kullanılması, plazmitlerin daha yüksek verimlilikle kullanılmasına izin verir. 3D bağırsak organoidleri geleneksel olarak geçici transfeksiyonlara dirençli olsa da, EGFP'yi kodlayan plazmitler, lipid bazlı transfeksiyon yöntemleri kullanılarak başarılı bir şekilde tanıtılabilir. PEI kullanan en uygun maliyetli yaklaşım adım 6.1'de özetlenmiştir (Şekil 5), ancak elektroporasyon ve ticari olarak temin edilebilen transfeksiyon reaktifleri de karşılaştırılabilir sonuçlar vermiştir (veriler gösterilmemiştir). Gelecekteki çalışmalar, bu yaklaşımların CRISPR yapılarını tek katmanlara sokmak için kullanılıp kullanılamayacağına odaklanacaktır.
Transfeksiyondan sonra 2D tek katmanlardan 3D organoidleri yeniden düzenleyebilmek önemliydi, böylece kriptlerin 3D mimari bileşenleri ile geçilebilir bir hat olarak korunabilirlerdi. İlginç bir şekilde, EME üzerine kaplanmış 2D tek tabakalar, EME hücrelerin tepesine geri eklendiğinde kolayca küçük sferoidlere dönüşürken, bir kollajen I substratı 3D yapıların yeniden oluşumu için yeterli değildi (Şekil 6).
Geçici transfeksiyonlar birçok çalışma için yararlı olsa da, kararlı çizgilerin oluşumu genellikle daha faydalıdır ve lentivirüsün hücrelere girmesini gerektirir. Sıçan bağırsak organoidleri, daha önce yayınlanmış protokoller değiştirilerek lentivirüs ile enfekte edildi (Şekil 7). Protokoldeki önemli bir adım, organoidlerin küçük kümelere veya hücre kümelerine parçalanmasıdır. Kültürler verimli bir şekilde bozulmazsa ve organoidler bozulmadan kalırsa, lentiviral parçacıklar hücrelere girmeyecektir. Enfeksiyondan sonra organoidler iyileşmeli ve yeniden büyümelidir. Burada özetlenen protokol, seçimden önce hücrelerin %10-48'i (ortalama: %19.4 ± %6.5) oranında viral partiküllerin alınmasına izin verir.
Organoidlerin tüm montaj boyaması, EME kalıntısının tam olarak çıkarılmaması veya eksik antikor penetrasyonu nedeniyle zor olabilir. Burada özetlenen protokol, organoidlerin sağlam bir şekilde boyanmasına izin verir. Organoidlerin konfokal mikroskopta görselleştirilmesi, lamelden çok uzaktalarsa da zor olabilir. VALAP kullanılarak, organoidlerin lamel tarafından ezilmeyeceği, ancak görüntüleme kolaylığı için yine de lamel yakınına yerleşmesine izin verilecek şekilde belirli bir yüksekliğe sahip bir kuyu oluşturulur. F-aktini etiketlemek için apikal anyon kanalı, kistik fibrozis transmembran iletkenlik regülatörü (CFTR) ve falloidine karşı temsili boyama Şekil 8'de gösterilmektedir.
Son olarak, organoidlerin fonksiyonel tahlillerde faydası vardır. Kistik fibroz hastalarından hasta kaynaklı organoidler, CFTR fonksiyonunu taramak için kullanılmıştır, çünkü cAMP agonisti forskolin ile tedavi, güçlü CFTR aracılı sıvı sekresyonunu indükleyerek organoid şişmeye neden olur 29,33-37. Bu çalışmanın bir amacı, in vivo klinik öncesi çalışmalara paralel olarak kullanılabilecek bir organoid modeli tanımlamak ve geliştirmekti. Bu nedenle, sıçan bağırsak organoidlerinin forskolin ile indüklenen şişmeye maruz kalıp kalmadığını belirlemeyi amaçladık. Gerçekten de, forskolin tedavisinden sonraki 30 dakika içinde, sıçan organoidleri, 120 dakika boyunca gözlenen maksimum etki ile şişti (Şekil 9).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig01.jpg"> Şekil 1: Epitelyal izolasyon sırasında villar fragmanlar ve kriptler. (A) Kript izolasyon protokolü sırasında EDTA çözeltisindeki villar fragmanlarının temsili görüntüsü. Sarı ok uçları villar parçalarını işaretler. Kırmızı oklar, bir villar parçasına bağlı kriptleri gösterir. Göreli boyutlardaki farka dikkat edin. (B) Morfolojinin görselleştirilebilmesi için tek bir kriptin daha yüksek büyütmeli görüntüsü (kırmızı ok). Ölçek çubukları: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig02.jpg"> Şekil 2: Sıçan bağırsağı organoid ilerlemesi. Sıçan jejunum kriptleri izolasyondan hemen sonra EME'de kaplandı (A,B). 2 gün içinde kriptler sferoid (C,D) haline geldi. 5. Günde, 7. Günde (G) detaylanan ve büyüyen kript tomurcuklarını (E,F) başlatmaya başladılar. Ölçek çubukları: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig03.jpg"> Şekil 3: Çözülme ve pasajdan sonra organoidler. (A) Sıçan jejunal organoidleri, kriyoprezervasyondan sonra belirtilen protokoller izlenerek çözüldü. Çözülmeden sadece 2 gün sonra hem sferoidlerin hem de tomurcuklanmış organoidlerin varlığına dikkat edin. (B) Belirtilen protokolü takiben geçtikten hemen sonra A'da gösterilen aynı organoid çizgi. A ve B'deki yapılar arasındaki göreli boyut farkına ve B'deki tek kript benzeri alanların varlığına dikkat edin. Ölçek çubukları: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig04.jpg"> Şekil 4: 3D organoidlerden 2D tek tabaka oluşumu. (A-C) EME'de 2D tek tabakalı ilerleme. (D-F) Kollajen I üzerinde 2 boyutlu tek tabakalı ilerleme. 5. günde, her koşul ~% 80 izdiham verdi. Ölçek çubukları: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig05.jpg"> Şekil 5: 2D tek katmanın geçici transfeksiyonu. PEI kullanılarak pLJM1-EGFP plazmidi ile geçici olarak transfekte edilen EME üzerinde büyütülen bir 2D tek tabakanın temsili görüntüsü. (A) Parlak alan, (B) floresan (GFP), (C) kaplama. Noktalı kırmızı çizgi, tek katmanlı sınırı işaretler. Ölçek çubukları: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig06.jpg"> Şekil 6: EME'de 2D tek tabakalardan 3D organoidlerin reformu. (A) EME üzerinde yetiştirilen 2D tek tabakalardan 3D organoidlerin oluşumu. Organoidler, tek tabakanın apikal yüzeyine EME eklendikten 5 gün sonra verimli bir şekilde oluşur. Küçük 3D sferoidleri çevreleyen ölü hücrelerin bolluğuna dikkat edin. (B) Kollajen I'den 5 gün sonra 2D tek tabakaların kalıcılığı, kollajen I üzerinde büyütülen 2D tek tabakaların apikal yüzeyine eklendi. Ölçek çubukları: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig07.jpg"> Şekil 7: 3D organoidlerin lentiviral enfeksiyonu. Sıçan jejunum organoidleri, belirtilen protokol kullanılarak nükleer GFP lentiviral partikülleri ile enfekte edildi. 5 gün boyunca iyileşme ve büyümeden sonra, organoidler sabitlendi ve DAPI ile boyandı. (A) DAPI: gri; nükleerGFP: yeşil. (B) nükleerGFP: yeşil. Noktalı kırmızı çizgi organoid sınırı işaretler. Ölçek çubukları: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig07large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig08.jpg"> Şekil 8: Sıçan bağırsak organoidlerinin tam montaj immünofloresansı. (A) CFTR, (B) falloidin ve (C) sıçan jejunal organoidlerinin tüm mount immünofloresansını birleştirdi. Organoidlerde CFTR boyamanın apikal zenginleşmesine dikkat edin (A'da gri, C'de macenta). Phalloidin, F-aktini işaretler ve apikal fırça sınırını belirgin bir şekilde işaretler (B'de gri, C'de camgöbeği). Ölçek çubukları: 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig08large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig09.jpg"> Şekil 9: Sıçan bağırsak organoidleri forskolin stimülasyonu üzerine şişer. cAMP agonisti forskolin ilavesinden sonra sıçan bağırsak organoid şişmesinin temsili zaman seyri. 0 dakikalık süre, 10 μM forskolin ilavesinden hemen önceki zaman noktasını temsil eder. Görüntüler aynı organoidi 30 dakikalık zaman aralıklarında göstermektedir. Forskolin ilavesinden 120 dakika sonra maksimal şişlik gözlendi. Noktalı kırmızı çizgi, organoid sınırın ana hatlarını çizer. Organoid lümenin ortasındaki koyu renkli madde ölü hücrelerden oluşur. Ölçek çubukları: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig09large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 1: AdDMEM+ tarifi. Burada gösterilen yöntemler boyunca temel ortam olan standart AdDMEM+ ortamını yapmak için malzemeler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/Table1_Re.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 2: Sıçan bağırsak organoid ortamı (rIOM) tarifi. Rekombinant proteinler için çözücü ve saklama koşulları dahil olmak üzere standart sıçan bağırsak organoid ortamının ayrıntılı tarifi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/Table2_RE.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 3: Çözümler. Protokol boyunca kullanılan diğer çözümleri yapmak için tarifler ve talimatlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/Table3_resub2_Re.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 4. 2D tek katmanlı kültür (rIOM2D) için sıçan bağırsak organoid ortamı. Tek tabakaların 2D büyümesi için optimize edilmiş organoid kültür ortamının değiştirilmiş tarifi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/Table4_resub2_RE.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Manipulation of Rat Intestinal Organoids at JoVE.com

Burada, sıçan bağırsak organoidleri üretmek ve bunları birkaç aşağı akış uygulamasında kullanmak için bir protokol sunuyoruz. Sıçanlar genellikle tercih edilen bir klinik öncesi modeldir ve sağlam bağırsak organoid sistemi, in vivo çalışmalara eşlik edecek bir in vitro sistem ihtiyacını karşılar.

When using organoids to assess physiology and cell fate decisions, it is important to use a model that closely recapitulates in vivo contexts. ...

Bu çalışmada, uzun süreli hücre kültüründe sağlam olan bir sıçan bağırsak organoid modeli oluşturduk. Ayrıca hem lentiviral enfeksiyon hem de geçici transfeksiyon kullanan ilk başarılı genetik manipülasyonları gösterdik. Bu model, in vivo olarak mevcut genetik araçların sınırlı olduğu sıçanlarda bağırsak biyolojisini manipüle etmek için mükemmel bir araçtır.Sıçan bağırsak organoidlerinin daha önce uzun süreli kültürlenmesi zordu. Sağlam, genetik olarak manipüle edilebilir bir sıçan organoid modeli oluşturarak, araştırmacılara kendi özel koşullarına en uygun organoid modelini seçmeleri için ek esneklik ve seçenek sunuyoruz. Fare bağırsak organoidleri, kök hücre davranışını, hücre kaderini ve fizyolojisini incelemek için kullanılır, ancak bunlar yetersiz bir model olabilir.Fare ve insan biyolojisi arasında önemli farklılıklar olduğu için. Öte yandan, insan bağırsak organoidlerinin elde edilmesi zor olabilir ve karmaşık hücre kültürü gereksinimlerine sahip olabilir. Burada tanımladığımız sıçan organoid modeli, insan bağırsak organoidlerine göre erişimi ve bakımı çok daha kolay olmakla birlikte, insan biyolojisi ile temel fizyolojik alaka düzeyini korur.Sıçan bağırsak organoid modelinin geliştirilmesi ve optimize edilmesi, genetik manipülasyona, farmakolojik tedavilere ve bağırsak biyolojisinin daha yüksek verimli çalışmalarına ve insanlar için temel fizyolojik önemi olan erişilebilir modele izin verir. Ek olarak, bu sıçan organoidleri, bağırsakta türe özgü fizyoloji, hücre kaderleri ve fenotipik varyasyonlar ve hastalık modellerinin incelenmesine izin verecektir.

Sıçan Bağırsak Organoidlerinin Üretimi ve Manipülasyonu

Abstract