В этом протоколе описаны различные методы, которые могут помочь в изучении биологии ATG9A, включая иммунофлуоресценцию с последующим анализом изображений, рассмотрение вопросов транзиторной гиперэкспрессии и исследование статуса гликозилирования ATG9A с помощью вестерн-блоттинга.
Аутофагия — это высококонсервативный путь, который клетка использует для поддержания гомеостаза, разрушения поврежденных органелл, борьбы с вторгшимися патогенами и выживания при патологических состояниях. Набор белков, называемых белками ATG, составляет основной механизм аутофагии и работает вместе в определенной иерархии. Исследования, проведенные в последние годы, улучшили наши знания о пути аутофагии. Совсем недавно было высказано предположение, что везикулы ATG9A находятся в центре аутофагии, поскольку они контролируют быстрый de novo синтез органеллы, называемой фагофором. Изучение ATG9A оказалось сложной задачей, поскольку ATG9A является трансмембранным белком и присутствует в различных мембранных компартментах. Таким образом, понимание его незаконного оборота является важным элементом для понимания аутофагии. Здесь представлены подробные методы, которые могут быть использованы для изучения ATG9A и, в частности, его локализации с помощью иммунофлуоресцентных методов, которые могут быть оценены и количественно определены. Также рассматриваются ловушки преходящей гиперэкспрессии. Правильная характеристика функции ATG9A и стандартизация методов анализа ее трафика имеют решающее значение для дальнейшей характеристики событий, управляющих инициацией аутофагии.
ATG9A является единственным трансмембранным белком основного механизма аутофагии и перемещается между Гольджи и цитозольным компартментом везикулы ATG9A, проходя через эндосомальный компартмент1. Долгое время оставаясь загадочным, ATG9A недавно был описан как липидный скрамблаз, поскольку он уравновешивает липиды через мембранные бислои 2,3. В настоящее время ясно, что ATG9A находится на вершине иерархии в образовании аутофагосом, и его изучение, таким образом, жизненно важно для понимания аутофагии 4,5. Таким образом, везикулы ATG9A недавно были предложены в качестве «семени» аутофагосомы 6,7. Однако предыдущие исследования показали, что ATG9A лишь временно взаимодействует с формирующейся аутофагосомой на разных стадиях ее созревания и не интегрируется в аутофагическую мембрану 6,8,9,10,11. Таким образом, необходимы дальнейшие исследования, чтобы полностью разгадать роль и потенциальные множественные функции ATG9A в образовании аутофагосом. Тем не менее, расхождение между текущими моделями и предыдущими данными может быть устранено только с помощью целенаправленных экспериментов, направленных на борьбу с незаконным оборотом ATG9A с использованием валидированных количественных подходов и внутриклеточных маркеров.
Для изучения ATG9A используются различные инструменты, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки, и использование этих инструментов осложняется структурой ATG9A, его молекулярной функцией и клеточным трафиком 2,8,12. ATG9A образует гомотример, гликозилируется и транспортируется по всей клетке в такие компартменты, как Гольджи, эндосомы и плазматическая мембрана13,14. Учитывая его сложный маршрут, существует несколько проблем при интерпретации показаний, таких как рассеивание ATG9A из Гольджи при специфическом лечении или стимулах (таких как голодание питательных веществ и сыворотки). ATG9A чрезвычайно динамичен с точки зрения везикулярного трафика; действительно, везикулы, содержащие ATG9A, были определены как компартмент ATG9A в контексте аутофагии, вызванной голоданием. Компартмент ATG9A, образованный этими динамическими везикулами, временно взаимодействует с несколькими внутриклеточными органеллами 8,15,16,17. Описанные здесь методы, включая иммунофлуоресценцию, живую визуализацию и анализ гликозилирования, должны помочь в обнаружении и понимании биологии ATG9A. В частности, подходы, описанные в этой статье, помогут ответить на вопросы локализации в конкретных клеточных компартментах и взаимодействии с конкретными белковыми партнерами и/или мембранными компартментами. Поскольку гидрофобный консервативный домен ядра ATG9A (PFAM домен PF04109) имеет уникальную топологию и циклы ATG9A между несколькими мембранными компартментами, исследователи должны знать об определенных подводных камнях и артефактах при временной гиперэкспрессии ATG9A, включая, помимо прочего, удержание эндоплазматического ретикулума (ER). Другие возможные проблемы могут возникнуть из-за неправильного сворачивания белка, артефактной агрегации в нормальных условиях выращивания или недостаточного обнаружения везикулярного компартмента из-за неоптимальных протоколов пермеабилизации для иммунофлуоресценции.
При визуализации эндогенного ATG9A необходимо соблюдать осторожность при подготовке образцов и получении изображений, чтобы обеспечить качество последующего количественного анализа и правильную интерпретацию данных. Сочетание методов, описанных в этой статье, со стандартными биохимическими подходами (такими как иммунопреципитация или эксперименты с вытягиванием, не описанные здесь) должно улучшить наше понимание функции ATG9A. Этот экспериментальный инструментарий предназначен для того, чтобы помочь новым исследователям сориентироваться в некоторых анализах, необходимых для определения функции ATG9A в их биологической системе.
Все реагенты, использованные в этом исследовании, коммерчески доступны, за исключением конструкций ДНК ATG9A и самодельного антитела STO-215 (см. таблицу материалов), которые доступны по запросу. Описанные здесь инструменты анализа основаны на программном обеспечении с открытым исходным кодом (FIJI/ImageJ)18.
1. Клеточная культура
2. Эндогенное окрашивание ATG9A
3. Получение изображения
4. Анализ изображения рассеивания ATG9A
5. Визуализация конструктов ATG9A в реальном времени
6. Исследование состояния гликозилирования ATG9A
ATG9A представляет собой трансмембранный белок, связанный с несколькими внутриклеточными мембранными компартментами 8,17,22,23,24. В базальных условиях ATG9A в основном локализуется в транс-сети Гольджи (TGN), на что указывает иммунофлуоресценция эндогенного белка и перекрытия с GM130, цис-маркером Гольджи (рис. 1A), а также в небольших везикулах, которые частично перекрываются с компартментом эндоцитарной рециркуляции (ERC)23. Локализация ATG9A в Гольджи может быть обнаружена с помощью различных иммунофлуоресцентных протоколов. Тем не менее, везикулярная фракция ATG9A, а также изменение ее локализации, в частности, увеличение везикулярного пула, в ответ на специфические стимулы, такие как голодание питательных веществ и сыворотки, могут быть довольно изменчивыми по интенсивности и трудно визуализироваться с помощью традиционных методов визуализации. Соотношение между ATG9A, локализованным в точке Гольджи, и ATG9A, локализованным в везикулярной фракции, называется скоростью дисперсии ATG9A. Для обнаружения изменений в скорости диспергирования ATG9A, например, при обработке EBSS, которая используется для истощения как сыворотки, так и аминокислот, полезны маркер Гольджи, такой как GM130 или TGN46, и маркер цитоскелета, такой как фаллоидин, который окрашивает контур клетки25, для быстрого количественного определения дисперсии ATG9A (рис. 1B). Важно отметить, что анализ среднего коэффициента флуоресценции можно интерпретировать только как сравнительную меру между условиями, а не как фиксированную скорость рассеивания. Соотношение между компартментами сильно зависит от биологических и небиологических факторов, таких как используемая клеточная линия, качество окрашивания или применяемые методы определения пороговых значений (рис. 1B). По этой причине исследователю необходимо настроить конвейер, способный обнаруживать обогащение ATG9A Гольджи в конкретных экспериментальных условиях, а затем распространять анализ с теми же параметрами на все изображения в анализируемом наборе. Репрезентативные бинарные изображения и области, выбранные для анализа средней флуоресценции ATG9A, показаны в качестве ориентира на рисунке 1B.
ATG9A содержит несколько трансмембранных доменов, окруженных двумя относительно гибкими и неструктурированными N- и C-концевыми доменами, из которых С-концевая последовательность охватывает почти половину белка12. Важно отметить, что на характер локализации гиперэкспрессии ATG9A может влиять то, какой конец белка помечен (рис. 2A). В частности, при использовании систем переходной экспрессии и маркировке ATG9A непосредственно на его N-конце флуоресцентной меткой (например, eGFP, mRFP или производными) его локализация Гольджи может быть частично нарушена, при этом меньшее обогащение наблюдается в базальных (т.е. вскормленных) условиях, в то время как везикулы ATG9A все еще хорошо видны (рис. 2A). Маркировка ATG9A на С-конце, по-видимому, немного индуцирует более крупные GFP-положительные кластеры, которые могут быть агрегированы. Наконец, мономерная версия mRFP-ATG9A также демонстрирует аналогичные флуоресцентные кластеры везикул и небольшое окрашивание по Гольджи в клетках с гиперэкспрессией (рис. 2A).
ATG9A сворачивается в мембране ER, прежде чем попасть в везикулы Гольджи и ATG9A. Во время своего пребывания в ER ATG9A модифицируется N-сцепленными гликанами на аспарагине 99, а затем, достигнув Гольджи, приобретает сложные, зрелые N-связанные гликаны 1,14. Эта модификация путем гликозилирования может быть обнаружена с помощью вестерн-блоттинга по появлению двойной полосы14. В соответствии со своей внутриклеточной локализацией, большинство эндогенных ATG9A содержат сложные N-связанные гликаны, и, следовательно, преобладает высокомолекулярная весовая полоса, а также видна слабая полоса нижнемолекулярной массы (рис. 2B). Наличие двойной полосы наиболее легко заметить при использовании трис-ацетатных гелей для улучшения разрешения высокомолекулярных белков (рис. 2B, контроль, t = 0). Когда эндогенный белок подвергается обработке PNGase F (пептид: N-гликозидаза F), которая удаляет большую часть сложных N-связанных гликанов, белок работает как одна полоса (рис. 2B, PNGase F, t = 0). Таким образом, статус N-связанного гликозилирования ATG9A может быть использован в качестве прокси для мониторинга выхода ATG9A из ER в Гольджи, что отражается относительным соотношением между двумя полосами.
При трансфектировании mRFP-ATG9A конструирует временно, сверхэкспрессированный белок первоначально накапливается в ER, возможно, из-за того, что механизм транспортировки не может сворачивать и транспортировать весь ATG9A, и преобладает полоса с более низкой молекулярной массой (рис. 2C, контрольная t = 0). Примечательно, что через 24 ч после экспрессии mRFP-ATG9A наблюдается примерно равное распределение между верхней и нижней полосами, что позволяет предположить, что пул mRFP-ATG9A перемещается в зону Гольджи (рис. 2C, контроль, t = 24). Если клетки обрабатывают циклогексимидом (CHX), который блокирует de novo синтез белка26, можно прояснить сворачивание и выход ATG9A из ER. Поскольку эндогенный белок сворачивается, гликозилируется и находится в системе Гольджи, лечение CHX существенно не изменяет соотношение низкомолекулярных и высокомолекулярных массовых полос (рис. 2B, контроль). Однако, используя переходную экспрессию mRFP-ATG9A, обработка CHX способствует накоплению более высокомолекулярной полосы массы (Рисунок 2C, Контроль, CHX t = 24). Высокомолекулярная сверхэкспрессия полосы mRFP-ATG9A после обработки PNGase F коллапсирует в нижнюю полосу (рис. 2C, PNGase F, t = 24). Эти данные показывают, что эндогенный белок быстро приобретает зрелые гликаны, что отражается в преобладании высокомолекулярной полосы, а погоня CHX не влияет на соотношение двойных полос (рис. 2Б). В случае транзиторной гиперэкспрессии mRFP-ATG9A лечение CHX индуцирует накопление верхней полосы, что указывает на то, что более зрелые гликаны приобретаются по мере того, как пул ER сворачивается и выходит из ER в Гольджи (рис. 2C).
Добавление линкера между последовательностью ATG9A и флуоресцентными метками может быть полезным для содействия более физиологической локализации и перемещению белка. Слияние последовательности 3x-FLAG (24 аминокислоты) между N-концевым флуорофором и ATG9A помогает сверхэкспрессируемому белку вести себя аналогично эндогенным (рис. 3). Действительно, гиперэкспрессия mCherry-3xFLAG-ATG9A локализуется с маркером Гольджи GM130 в условиях кормления (рис. 3A). Важно отметить, что эта локализация и везикулярный компартмент ATG9A сохраняются с течением времени, что позволяет проводить пространственно-временные исследования транспорта ATG9A (рис. 3B).
Рисунок 1: Анализ изображений эндогенной локализации ATG9A. (A) Репрезентативное иммунофлуоресцентное изображение эндогенного ATG9A (красный), GM130 в качестве маркера Гольджи (зеленый) и фаллоидина для визуализации актинового цитоскелета (голубой). Масштабная линейка = 10 мкм. (B) Рабочий процесс анализа изображений для определения фракции эндогенного ATG9A, который локализуется в области Гольджи. Масштабная линейка = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Анализ флуоресцентно меченых конструкций ATG9A по локализации и гликозилированию. (A) eGFP N-терминально меченый ATG9A менее локализован в Гольджи и в основном находится в везикулах. С-концевая метка eGFP ATG9A демонстрирует агрегаты внутри клетки (некоторые примеры отмечены белыми стрелками; eGFP-ATG9A и ATG9A-eGFP выделены зеленым цветом). mRFP N-терминально меченый ATG9A менее локализован в Гольджи и в основном находится в везикулах. N обозначает приблизительное местоположение клеточного ядра, а mRFP-ATG9A выделен красным цветом. Масштабная линейка = 5 мкм. (B) Эндогенный ATG9A выглядит как две полосы при анализе с помощью вестерн-блоттинга (стрелки): верхняя полоса (сложные N-связанные гликаны) и нижняя полоса (без зрелых N-связанных гликанов). Лечение циклогексамидом (CHX) не влияет на соотношение между верхней и нижней полосами. Лечение PNGase F вызывает исчезновение верхней полосы. (C) После транзиторной трансфекции помеченного mRFP ATG9A в HEK293A клетках на вестерн-блоттинге (наконечники стрелок) видны две заметные полосы. Лечение PNGase F вызывает исчезновение верхней полосы. Лечение CHX после трансфекции приводит к усилению гликозилирования, так как пул трансфицированного ATG9A транспортируется из ER в Гольджи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Анализ локализации mCherry-3xFLAG-ATG9A методом иммунофлуоресценции и визуализации в реальном времени. (A) Иммунофлуоресцентные эксперименты с HEK293A клетками, временно гиперэкспрессирующими mCherry-3xFLAG-ATG9A и окрашенными маркером Гольджи GM130. Масштабная линейка = 10 мкм. mCherry-3xFLAG-ATG9A выполнен в красном цвете, а маркер GM130 Golgi — в зеленом. (B) Монтаж из экспериментов по визуализации в HEK293A клетках с временной гиперэкспрессией mCherry-3xFLAG-ATG9A. N обозначает приблизительное расположение ядра. Таймфрейм = 1 кадр в секунду. Масштабная линейка = 10 мкм. mCherry-3xFLAG-ATG9A окрашен в красный цвет. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Это исследование иллюстрирует различные инструменты, которые могут быть использованы для исследования локализации ATG9A. Во-первых, в этом исследовании описывается, как ATG9A может быть визуализирован с помощью иммунофлюоресценции и как это может быть количественно оценено. Во-вторых, сравниваются стратегии, которые могут быть использованы для маркировки ATG9A флуоресцентным маркером для визуализации как в фиксированных, так и в живых клетках. Наконец, в этой работе описывается, как исследовать и использовать состояние гликозилирования ATG9A, чтобы определить, вышел ли ATG9A из ER и прошел ли он через Гольджи.
Что касается характеристики эндогенной локализации ATG9A методом иммунофлуоресценции, необходимо соблюдать осторожность с методами фиксации и пермеабилизации, используемыми в эксперименте. В соответствии со стандартными процедурами, описанными здесь, фиксация параформальдегида в сочетании с пермеабилизацией дигитонина являются хорошими условиями для визуализации как ассоциированных с Гольджи ATG9A, так и ATG9A-положительных везикул7. Наряду с фиксацией и пермеабилизацией решающее значение имеет и время инкубации с первичным раствором антител. Мы наблюдали, но не задокументировали, что более высокие концентрации раствора первичных антител и более длительный инкубационный период могут привести к искаженному увеличению окрашивания ATG9A по методу Гольджи, что в конечном итоге ставит под угрозу обнаружение перераспределения ATG9A в другие мембранные компартменты. Кроме того, поскольку ATG9A присутствует во многих внутриклеточных компартментах 1,13,17,22,23,24,27,28, важно использовать специфические мембранные маркеры вместе с ATG9A, чтобы определить, где находится ATG9A. В прошлом для количественной оценки локализации ATG9A использовалось несколько подходов, в том числе коэффициент корреляции Пирсона для колокализации29. Однако частичное перекрытие ATG9A с Гольджи и отдельным везикулярным компартментом приводит к большому количеству пиксельных выбросов, что может исказить интерпретацию коэффициента корреляции. По этой причине предпочтительным является более упрощенный подход, основанный на соотношении средней флуоресценции в двух анализируемых компартментах, и этот подход менее чувствителен к межклеточной изменчивости. Для получения дополнительной информации об анализе изображений с помощью микроскопии читатели могут обратиться к главе30 этой книги.
При исследовании статуса гликозилирования ATG9A важен выбор гелей для проведения вестерн-блоттинга. Для этого протокола предпочтительны 3%-8% гели с трис-ацетатом, поскольку они обеспечивают самое высокое разрешение для более крупных белков, но также можно использовать альтернативные гелевые композиции или работающие буферы, которые обеспечивают хорошее разделение высокомолекулярных белков. Экспериментатор может обеспечить максимальное разделение белков, увеличив время электрофореза.
При подготовке образцов для визуализации ATG9A на вестерн-блоттинге следует соблюдать осторожность, чтобы не кипятить образцы после добавления буфера Леммили; кипячение при 95 °C индуцирует образование агрегатов ATG9A, и, следовательно, ATG9A не может эффективно мигрировать в гель1. Рекомендуется нагревать образцы при 65 °С в течение 5 мин27.
Высокие уровни трансфекции обычно приводят к более высокому накоплению ATG9A в ER, в то время как умеренные уровни экспрессии помогают физиологической локализации белка. Как ни странно, инкубационное время 72 ч вместо 48 ч часто помогает уменьшить артефакты локализации ER. Примечательно, что mRFP-ATG9A может точно сообщать о транспорте ATG9A и функционировать, если уровни контролируются с помощью уровней экспрессии или с помощью стабильных клеточных линий 8,9,22,27.
Неспособность популяции гиперэкспрессированных ATG9A получить зрелые N-связанные гликаны может быть использована в качестве считывания для возмущенного трафика ATG9A. При мутации или удалении определенных участков ATG9A существует риск повышенной задержки ER, что может привести к неудаче в получении зрелых N-связанных гликанов и, таким образом, к более быстрой миграции полосы ATG9A на вестерн-блоттинге. Исследователи, работающие с усеченными конструкциями ATG9A, должны проверять удержание ER, состояния гликозилирования и локализацию по Гольджи.
Для визуализации живых клеток ATG9A микроскоп Airyscan, основанный на функции быстрого Airyscan, обеспечивает оптимальное разрешение, как правило, около 120 нм. Для точности локализации частота кадров около 1-2 кадров в секунду (fps) в режиме сверхвысокого разрешения является оптимальной в зависимости от количества каналов изображения. Аналогичные конфокальные микроскопы, которые могут получать изображения с высокой скоростью, также могут быть использованы для визуализации везикул ATG9A; Однако следует отметить, что скорость визуализации может напрямую влиять на обнаружение событий и, следовательно, влиять на интерпретацию данных.
Таким образом, представленные протоколы описывают способы количественной оценки и характеристики локализации ATG9A методами иммунофлюоресценции, микроскопии живых клеток и статуса гликозилирования. Эти протоколы могут помочь исследователям, работающим с ATG9A, и помочь избежать некоторых подводных камней.
Авторы благодарят Рокко Д'Антуоно (Rocco D'Antuono) за корректуру рукописи, а также всех нынешних и бывших сотрудников лаборатории молекулярной клеточной биологии аутофагии (MCBA) за обсуждения, которые привели к уточнению этих протоколов. A. V.V., S.D.T., E.A., S.A.T. были поддержаны Институтом Фрэнсиса Крика, который получает основное финансирование от Cancer Research UK (CC2134) и Совета по медицинским исследованиям Великобритании (CC2134). Это исследование было полностью или частично профинансировано Wellcome Trust (CC2134). В целях открытого доступа автор применил публичную лицензию CC BY к любой версии рукописи, принятой автором, возникшей в результате этой статьи.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
24 multiwell plates | Falcon | 353047 | For tissue culture |
35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated | MATTEK | P35G-1.5-14-C | Cell culture dish for live-cell microscopy |
4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
60 mm tissue culture dish | Thermofischer Scientific | 10099170 | For tissue culture |
Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermofischer Scientific | A22287 | Actin stain |
anti-ATG9A antibody | home made | STO-215 | Rabbit anti N-terminal peptide ATG9A |
anti-Rabbit IgG, peroxidase-linked | Invitrogen | 10794347/NA934-1ml | Secondary antibody for rabbit polyclonal STO-215 |
anti-RFP antibody | Evrogen | AB233 | for Western Blot |
ATG9A Monoclonal Antibody (14F2 8B1), Invitrogen | Invitrogen | 15232826 | Antibody for immunofluorescence |
ATG9A-eGFP | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
Bemis Parafilm | Thermofischer Scientific | 11747487 | self-sealing thermoplastic film |
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | For determining protein concentration |
Bovine serum albumin (BSA) | Merck | 10735086001 | For blocking non-specific labelling |
CaCl2.2H2O | / | For PBS and EBSS | |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | Supplement in lysis buffer to prevent protein degradation |
Cy3 AffiniPure Goat Anti-Armenian Hamster IgG | Jackson ImmunoResearch | 127-165-099 | Secondary antibody for i14F2 8B1 antibody for mmunofluorescence |
Cyclohexamide | Sigma Aldrich | 66-81-9 | To stop protein translation |
D-Glucose | / | For EBSS | |
Digitonin | Merck | 300410 | For permeabilizing cells |
DMEM | Merck | D6546-6x500ml | For tissue culture |
eGFP-ATG9A | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | Supplement for DMEM for cell culture |
FIJI (ImageJ) | / | https:/fiji.sc/ | Open source image analysis software |
Hoechst | Thermofischer Scientific | H3570 | Stains the nucleus |
KCl | / | For EBSS | |
L-glutamine | Sigma | 67513 | For tissue culture |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | For Cell Transfection |
LSM880 Airyscan microscope | Zeiss | / | Confocal microscopy |
MgCl2 | / | For PBS | |
MgSO4.7H2O | / | For EBSS | |
Mowiol mounting solution | Millipore | 475904 | for permanent mounting glass coverslips |
NaCl | / | For EBSS | |
NaH2PO4.2H2O | / | For EBSS | |
NaHCO3 | / | For EBSS | |
NuPAGE 3 to 8%, Tris-Acetate, 1.5 mm, Mini Protein Gels | Thermofischer Scientific | EA0378BOX | for Western Blotting |
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Life Tech | NP0002 | for Western Blotting |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo | 31985062 | For Cell Transfection |
Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1026 | For fixing cells |
pcDNA3.1-mCherry-3xFlag-ATG9A | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | / | For tissue culture | |
PNGaseF | NEB | P0710S | To remove N-linked glycans |
Poly-D-lysine hydrobromide mol wt 70,000-150,000 | Merck | P0899 | For coating coverslips |
Rapid PNGase F enzyme | NEB | P07105 | To remove N-linked glycans |
RFP-ATG9A | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
Triton X-100 | Thermofischer Scientific | 13454259 | Detergent for Cell lysis |
Trypsin-EDTA solution | Sigma | T4049 | For tissue culture |
Whatman Filter Paper | Merck | WHA1001325 | For Western Blot and IF |
XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Invitrogen | EI0001 | For Western Blotting |
Zen Black edition | Zeiss | / | Used to operate the LSM 880 |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved