Обогащение мРНК и бисульфит-мРНК Подготовка библиотек для секвенирования нового поколения

Summary

Этот протокол обеспечивает простой рабочий процесс для проведения очистки поли(А)-РНК, бисульфитной конверсии и подготовки библиотеки с использованием стандартизированного оборудования для получения интересующего биологического образца.

Abstract

Посттранскрипционные модификации РНК в различных типах транскриптов РНК связаны с разнообразной регуляцией РНК в эукариотических клетках. Было показано, что аберрантные модификации РНК-5-метилцитозина и нерегулируемая экспрессия РНК-метилтрансфераз связаны с различными заболеваниями, включая рак. Для характеристики положения и количественных уровней метилирования цитозина в бисульфит-превращенной РНК при разрешении пары оснований было разработано полнотранскриптомное бисульфитное секвенирование. В настоящем протоколе подробно описаны процедуры двух раундов очистки поли(А) РНК, трех циклов бисульфитной реакции и подготовки библиотеки, позволяющие проводить транскриптомное картирование сайтов модификации мРНК 5-метилцитозина. Оценка количества и качества РНК после основной реакции имеет важное значение для контроля целостности РНК и является критически важным шагом для обеспечения высококачественных библиотек секвенирования. В идеале процедуры можно завершить в течение трех дней. С помощью этого протокола, используя высококачественную общую РНК в качестве входных данных, можно практически создать надежные библиотеки бисульфит-мРНК для секвенирования следующего поколения из интересующего образца.

Introduction

Среди более чем 150 типов посттранскрипционных модификаций¹ модификация 5-метилцитозина (м⁵С) была идентифицирована в различных типах РНК, включая рибосомную РНК, транспортную РНК, матричную РНК, микроРНК, длинную некодирующую РНК, опорную РНК, энхансерную РНК и малые кажальные тельцеспецифичные РНК². РНК m 5 C связана с различными биологическими и патологическими механизмами, такими как регуляция развития корней растений³, экспрессия вирусных генов⁴ и прогрессирование рака⁵. Целью данного протокола является предоставление оптим....

Protocol

1. Очистка поли(А) РНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте общую РНК, обработанную ДНКазой I, и проверьте качество и целостность общей РНК путем оценки капиллярного или обычного гель-электрофореза, прежде чем приступать к очистке поли(А) РНК. Исследователи должны быть в состоя?.......

Discussion

В этом протоколе детальный конвейер обогащения поли(А), бисульфитной конверсии и подготовки библиотеки был достигнут за счет использования стандартизированных компонентов. Дальнейший секвенированный анализ позволил идентифицировать мРНК-5-метилцитозин в интересующих образцах.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System	Agilent, Santa Clara, CA		RNA quality detection
AMpure XP beads	Beckman Coulter	A63881	purify DNA
Bioanalyzer DNA high sensitivity kit	Agilent, Santa Clara, CA	5067-4626	DNA quality dection
Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit	Agilent, Santa Clara, CA	5067-1513	RNA quality dection
DiaMag02 - magnetic rack	Diagenode, Denville, NJ	B04000001	assist library preparation
DiaMag1.5 - magnetic rack	Diagenode, Denville, NJ	B04000003	assist poly(A) RNA purificaion
Dynabeads mRNA DIRECT purification kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	61011	poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2
Ethanol	J.T.Baker	64-17-5
EZ RNA methylation kit	Zymo, Irvine, CA	R5002	bisulfite treatment
Firefly luciferase mRNA	Promega, Madison, WI, USA	L4561	spike in control seqeunce
KAPA Library Quantification Kits	Roche, Switzerland	KK4824	library quantification
Nanodrop spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA		Total RNA quantity detection
NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1)	New England Biolabs, Ipswich, MA	E7335S	library preparation
NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit for Illumina	New England Biolabs, Ipswich, MA	E7760S	library preparation
Nuclease-free Water	Thermo Fisher Scientific	AM9932
P2 pipetman	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	4641010
Qubit 2.0 fluorometer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA		RNA quantity detection
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	Q32854	DNA quantity detection
Qubit RNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	Q32852	RNA quantity detection