تم دعم هذا العمل من قبل قسم العلوم الصيدلانية والدوائية ، جامعة بادوفا (PRIDJ-BIRD2019).

1. إعداد الحمض النووي والمسبار الكيميائي
<ol><li>الأحماض النووية ملاحظة: قليل النوكليوتيد المسمى "TBA" هو تسلسل الحمض النووي 15-mer 5'-GGT-TGG-TGT-GGT-TGG-3' المسمى في النهاية 3'بواسطة الفلوروفور 5-كربوكسي فلوريسئين (FAM) لتمكين التصور على الهلام. قليل النوكليوتيد غير المسمى "cTBA" هو تسلسل الحمض النوو...

تحديد رباعيات G في قالب الحمض النووي باستخدام رسم الخرائط الكيميائية

<ol>
	<li>Davis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-quartets+40+years+later:+from+5'-GMP+to+molecular+biology+and+supramolecular+chemistry.">G-quartets 40 years later: from 5'-GMP to molecular biology and supramolecular chemistry.</a> Angewandte Chemie. 43 (6), 668-698 (2004).</li><li>Varshney, D., Spiegel, J., Zyner, K., Tannahill, D., Balasubramanian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+and+functions+of+DNA+and+RNA+G-quadruplexes.">The regulation and functions of DNA and RNA G-quadruplexes.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (8), 459-474 (2020).</li><li>Chambers, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+sequencing+of+DNA+G-quadruplex+structures+in+the+human+genome.">High-throughput sequencing of DNA G-quadruplex structures in the human genome.</a> Nature Biotechnology. 33 (8), 877-881 (2015).</li><li>Zuravka, I., Sosic, A., Gatto, B., Gottlich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+evaluation+of+a+bis-3-chloropiperidine+derivative+incorporating+an+anthraquinone+pharmacophore.">Synthesis and evaluation of a bis-3-chloropiperidine derivative incorporating an anthraquinone pharmacophore.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 25 (20), 4606-4609 (2015).</li><li>Zuravka, I., Roesmann, R., Sosic, A., Gottlich, R., Gatto, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bis-3-chloropiperidines+containing+bridging+lysine+linkers:+Influence+of+side+chain+structure+on+DNA+alkylating+activity.">Bis-3-chloropiperidines containing bridging lysine linkers: Influence of side chain structure on DNA alkylating activity.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry. 23 (6), 1241-1250 (2015).</li><li>Zuravka, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+DNA+cleavage+activity+of+bis-3-chloropiperidines+as+alkylating+agents.">Synthesis and DNA cleavage activity of bis-3-chloropiperidines as alkylating agents.</a> ChemMedChem. 9 (9), 2178-2185 (2014).</li><li>Sosic, A., Gottlich, R., Fabris, D., Gatto, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-CePs+as+cross-linking+probes+for+the+investigation+of+RNA+higher-order+structure.">B-CePs as cross-linking probes for the investigation of RNA higher-order structure.</a> Nucleic Acids Research. 49 (12), 6660-6672 (2021).</li><li>Sosic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bis-3-chloropiperidines+targeting+TAR+RNA+as+a+novel+strategy+to+impair+the+HIV-1+nucleocapsid+protein.">Bis-3-chloropiperidines targeting TAR RNA as a novel strategy to impair the HIV-1 nucleocapsid protein.</a> Molecules. 26 (7), 1874 (2021).</li><li>Sosic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evaluation+of+bis-3-chloropiperidines+as+RNA+modulators+targeting+TAR+and+TAR-protein+interaction.">In vitro evaluation of bis-3-chloropiperidines as RNA modulators targeting TAR and TAR-protein interaction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (2), 582 (2022).</li><li>Sosic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+topoisomerase+II+mediated+DNA+damage+by+bis-3-chloropiperidines:+The+importance+of+being+an+earnest+G.">Direct and topoisomerase II mediated DNA damage by bis-3-chloropiperidines: The importance of being an earnest G.</a> ChemMedChem. 12 (17), 1471-1479 (2017).</li><li>Bock, L. C., Griffin, L. C., Latham, J. A., Vermaas, E. H., Toole, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+single-stranded+DNA+molecules+that+bind+and+inhibit+human+thrombin.">Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin.</a> Nature. 355 (6360), 564-566 (1992).</li><li>Paborsky, L. R., McCurdy, S. N., Griffin, L. C., Toole, J. J., Leung, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single-stranded+DNA+aptamer-binding+site+of+human+thrombin.">The single-stranded DNA aptamer-binding site of human thrombin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 268 (28), 20808-20811 (1993).</li><li>Carraro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behind+the+mirror:+chirality+tunes+the+reactivity+and+cytotoxicity+of+chloropiperidines+as+potential+anticancer+agents.">Behind the mirror: chirality tunes the reactivity and cytotoxicity of chloropiperidines as potential anticancer agents.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 10 (4), 552-557 (2019).</li><li>Carraro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appended+aromatic+moieties+in+flexible+bis-3-chloropiperidines+confer+tropism+against+pancreatic+cancer+cells.">Appended aromatic moieties in flexible bis-3-chloropiperidines confer tropism against pancreatic cancer cells.</a> ChemMedChem. 16 (5), 860-868 (2021).</li><li>Kypr, J., Kejnovska, I., Renciuk, D., Vorlickova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+dichroism+and+conformational+polymorphism+of+DNA.">Circular dichroism and conformational polymorphism of DNA.</a> Nucleic Acids Research. 37 (6), 1713-1725 (2009).</li><li>Onel, B., Wu, G., Sun, D., Lin, C., Yang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assay+and+dimethyl+sulfate+footprinting+for+characterization+of+G-quadruplexes+and+G-quadruplex-protein+complexes.">Electrophoretic mobility shift assay and dimethyl sulfate footprinting for characterization of G-quadruplexes and G-quadruplex-protein complexes.</a> Methods in Molecular Biology. 2035, 201-222 (2019).</li></ol>

G-quadruplexes هي هياكل ثانوية للحمض النووي تطوى عادة داخل تسلسل الحمض النووي الغني بالجوانين ، وهي أهداف بحثية مهمة بسبب ارتباطها بالتحكم الجيني والأمراض. يعد رسم الخرائط الكيميائية بواسطة B-CePs بروتوكولا مفيدا لتوصيف الحمض النووي G4s ، والذي يمكن استخدامه لتحديد قواعد الجوانين المشاركة في تكوي?...

بالإضافة إلى الحلزون المزدوج النموذجي Watson-Crick ، يمكن للأحماض النووية اعتماد هياكل ثانوية مختلفة ، مثل الشكل البديل G-quadruplex (G4) ، بسبب تسلسلاتها الغنية بالجوانين. يعتمد هيكل G4 على تكوين رباعيات مستوية ، تسمى G-tetrades ، حيث تتفاعل أربعة جوانين من خلال روابط هيدروجينية Hoogsteen. يتم تكديس G-tetrads وتثبيتها بشكل أكبر بواسطة الكاتيونات أحادية التكافؤ التي يتم تنسيقها في وسط قلب الجوانين (الشكل 1)1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65373/65373fig01.jpg"> الشكل 1: تمثيل تخطيطي لهيكل G-quadruplex. (أ) تمثيل تخطيطي لرباعي G. يتم تثبيت الصفيف المستوي بواسطة اقتران قاعدة Hoogsteen وبواسطة كاتيون مركزي (M +). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65373/65373fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
التسلسلات التي تحتوي على أربعة أشواط أو أكثر من نيوكليوتيدات الجوانين المتتالية على الأقل هي تسلسلات محتملة لتشكيل G-quadruplex (PQSs) يمكن طيها في هياكل G-quadruplex. توجد PQSs في العديد من السياقات الخلوية المختلفة ، مثل التيلوميرات ، ومروجات الجينات ، والحمض النووي الريبوسومي ، ومواقع إعادة التركيب ، وتشارك في تنظيم العديد من العمليات البيولوجية2. ومن ثم، فإن تحديد G4s والتحقق التجريبي من صحتها في الجينوم البشري، والذي يتم إجراؤه حاليا في المقام الأول من خلال الأدوات الحسابية، هو قضية ذات صلة بيولوجية3. من أجل دعم التنبؤات الحسابية أو الكشف عن هياكل G4 غير المتوقعة ، يتم عرض طريقة يمكن الوصول إليها تعتمد على رسم الخرائط الكيميائية لتحديد تكوين G4 في قالب الحمض النووي هنا ، مما يتيح التحديد الدقيق للجوانين التي تشكل بنية G-tetrad.
يستغل اختبار رسم الخرائط الكيميائية المبلغ عنه التفاعل المختلف لثنائي 3-كلوروبيريدين (B-CePs) مع الجوانين بعد تكوين هياكل G4. نظرا لتفاعلها العالي مع النيوكليوفيليات4،5،6،7،8،9 ، فإن B-CePs هي عوامل ألكلة الحمض النووي مع القدرة على التفاعل بكفاءة عالية مع موضع N7 من نيوكليوتيدات الجوانين10. يتبع الألكلة التطهير والانقسام الخيطي في تركيبات الحمض النووي المفردة والمزدوجة الشريط. على العكس من ذلك ، فإن الجوانين المشاركة في تكوين G-tetrads في ترتيبات G4 منيعة على ألكلة B-CeP ، حيث أن موضع N7 من الجوانين متورط في روابط Hoogsteen الهيدروجينية. لا يسمح هذا التفاعل المحدد ل B-CePs باكتشاف هياكل G4 فحسب ، بل يسمح أيضا بتحديد الجوانين التي تشكل رباعي (رباعيات) ، حيث يمكن استنتاجها من حمايتها النسبية من الألكلة مقارنة بالجوانين في الحمض النووي أحادي ومزدوج الشريط.
تم الإبلاغ عن بروتوكول رسم الخرائط الكيميائية هنا باستخدام B-CeP 1 (الشكل 2A) كمسبار لتوصيف أبتامير المرتبط بالثرومبين (TBA) ، وهو حمض نووي 15-mer قادر على افتراض ترتيب G4 في وجود كاتيونات البوتاسيوم11,12. تتم مقارنة ترتيب G4 ل TBA (G4-TBA) مباشرة مع اثنين من عناصر التحكم ، وهما TBA في الشكل أحادي الشريط (ssTBA) و TBA الملدن إلى تسلسله التكميلي لتشكيل البناء المزدوج الذي تقطعت به السبل (dsTBA) (الجدول 1). يتم حل نواتج تفاعلات الفحص عن طريق الرحلان الكهربائي عالي الدقة لهلام بولي أكريلاميد (PAGE) على مستوى النوكليوتيدات المفردة عن طريق تحديد موقع مضافات الألكلة الفردية وانقسام حبلا الحمض النووي عند الجوانين الألكيل. يتم تمكين التصور على الجل عن طريق اقتران قليل النوكليوتيد TBA مع فلوروفور في نهايته 3'-end (الجدول 1). يوضح هذا البروتوكول كيفية طي TBA في مطابقاته المختلفة (G4 وعناصر التحكم) ، وكيفية إجراء تفاعلات التحقيق مع B-CePs متبوعة ب PAGE.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylamide/bis-acrylamide solution 40%</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3658</td>
			<td>R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/ 
			24/25-62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium per-sulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>pbi international</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue Brilliant blue R</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B0149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-Sodium hydrogen phosphate dodecahydrate</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>71649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotides</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>synthesis of custom sequences</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>40248</td>
			<td>H351-360D-373</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imager</td>
			<td>GE Healtcare</td>
			<td>STORM B40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tubes 0.5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing apparatus</td>
			<td>Biometra</td>
			<td>Model S2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silanization solution I</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>85126</td>
			<td>H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>480086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speedvac concentrator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Savant DNA 120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>87689</td>
			<td>R11-21/22-23-34</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.08387.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>51456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Nanodrop 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro chemical mapping of g-quadruplex dna structures by bis-3-chloropiperidines

G-quadruplexes (G4s) هي هياكل الحمض النووي غير المتعارف عليها بيولوجيا والتي تلعب دورا مهما في التعبير الجيني والأمراض ، وتمثل أهدافا علاجية مهمة. هناك حاجة إلى طرق يمكن الوصول إليها لتوصيف الحمض النووي في المختبر ضمن تسلسلات تشكيل G-quadruplex المحتملة (PQSs). B-CePs هي فئة من عوامل الألكلة التي أثبتت أنها مجسات كيميائية مفيدة للتحقيق في البنية ذات الترتيب الأعلى للأحماض النووية. تصف هذه الورقة مقايسة رسم خرائط كيميائية جديدة تستغل التفاعل النوعي ل B-CePs مع N7 من الجوانين ، متبوعا بالانقسام المباشر في Gs الألكيلية. 
وبالتحديد ، لتمييز طيات G4 عن أشكال الحمض النووي غير المطوية ، نستخدم B-CeP 1 لفحص أبتامير المرتبط بالثرومبين (TBA) ، وهو حمض نووي 15 مير قادر على تحمل ترتيب G4. ينتج عن تفاعل الجوانين المستجيب ل B-CeP مع B-CeP 1 منتجات يمكن حلها عن طريق الرحلان الكهربائي عالي الدقة لهلام بولي أكريلاميد (PAGE) على مستوى نيوكليوتيد واحد عن طريق تحديد موقع مقرب الألكلة الفردي وانقسام حبلا الحمض النووي في الجوانين الألكيل. يعد رسم الخرائط باستخدام B-CePs أداة بسيطة وقوية للتوصيف المختبري لتسلسلات الحمض النووي المكونة ل G-quadruplex ، مما يتيح تحديد الموقع الدقيق للجوانين المشاركة في تكوين G-tetrads.

In addition to the typical Watson-Crick double helix, nucleic acids can adopt various secondary structures, such as the alternative G-quadruplex (G4) form, due to their guanine-rich sequences. G4 structure is based on the formation of planar tetramers, called G-tetrads, in which four guanines interact through Hoogsteen hydrogen bonds. G-tetrads are stacked and further stabilized by monovalent cations that are coordinated in the center of the guanine core (Figure 1)1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65373/65373fig01.jpg" /> 
Figure 1: Schematic representation of a G-quadruplex structure. (A) Schematic representation of a G-tetrad. The planar array is stabilized by Hoogsteen base-pairing and by a central cation (M+).&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65373/65373fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Sequences with four or more runs of at least two consecutive guanine nucleotides are potential G-quadruplex-forming sequences (PQSs) that can fold in G-quadruplex structures. PQSs are located in many different cellular contexts, such as at telomeres, gene promoters, ribosomal DNA, and recombination sites, and are involved in the regulation of many biological processes2. Hence, the identification and experimental validation of G4s in the human genome, which is currently performed primarily through computational tools, is a biologically relevant issue3. In order to support computational predictions or detect unpredicted G4 structures, an accessible method based on chemical mapping to identify the G4 formation in a DNA template is shown here, enabling the precise identification of guanines forming the G-tetrad structure.
The reported chemical mapping assay exploits the different reactivity of bis-3-chloropiperidines (B-CePs) with guanines following the formation of G4 structures. Due to their high reactivity with nucleophiles4,5,6,7,8,9, B-CePs are nucleic acid-alkylating agents with the ability to react very efficiently with the N7 position of guanine nucleotides10. Alkylation is followed by depurination and strand cleavage in single- and double-stranded DNA constructs. On the contrary, guanines involved in the formation of the G-tetrads in G4 arrangements are impervious to B-CeP alkylation, as the N7 position of guanines is implicated in the Hoogsteen hydrogen bonds. This specific reactivity of B-CePs allows not only the detection of G4 structures, but also the identification of the guanines forming the tetrad(s), as they can be deduced from their relative protection from alkylation compared with guanines in single- and double-stranded DNA.
The chemical mapping protocol is reported here using B-CeP 1 (Figure 2A) as a probe for the characterization of thrombin-binding aptamer (TBA), a 15-mer DNA able to assume the G4 arrangement in the presence of potassium cations11,12. The G4 arrangement of TBA (G4-TBA) is directly compared with two controls, namely TBA in the single-stranded form (ssTBA) and TBA annealed to its complementary sequence to form the double-stranded construct (dsTBA) (Table 1). Products of probing reactions are resolved by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) at the single-nucleotide level by locating individual alkylation adducts and DNA strand cleavage at the alkylated guanines. Visualization on the gel is enabled by conjugation of the TBA oligonucleotide with a fluorophore at its 3&#39;-end (Table 1). This protocol shows how to fold TBA in its different conformations (G4 and controls), and how to perform probing reactions with B-CePs followed by PAGE.

تسليط الضوء على المؤلف: توصيف الحمض النووي G-quadruplex بواسطة رسم الخرائط الكيميائية القائمة على Bis-3-Chloropiperidine 

في المختبر رسم الخرائط الكيميائية لهياكل الحمض النووي G-quadruplex بواسطة Bis-3-chloropiperidines

G-quadruplex are nucleic acid secondary structures that typically formed within guanine-rich DNA sequences. The chemical mapping of G4 by B-CePs aims at the in vitro characterization of G4, and allows the identification of the specific guanines forming the G-tetrads. The identification and the experimental validation of G4s within potential G-quadruplex-forming sequences is a biologically relevant issue, which is currently addressed primary through computational tools.To support such predictions and detect the unpredicted G4, chemical mapping by B-CePs represents an accessible method to identify G4 in DNA sequences. The chemical mapping by B-CePs is a convenient alternative to the widely used dimethyl sulfate footprinting protocol for the characterization of G-quadruplex. The key advantage by B-CePs is that it reduces the number of steps in the protocol and it reduces the initial amount of the DNA substrate.The chemical mapping by B-CePs is described here with the TBA sequence as a proof of concept. The protocol will lead to new experiments applicable to any other potential G-quadruplex-forming sequence exploring both DNA and RNA constructs.

يوضح الشكل 2 نتيجة تمثيلية لمقايسة رسم الخرائط الكيميائية التي تم إجراؤها ، كما هو موضح في البروتوكول مع B-CeP 1 على قليل النوكليوتيد TBA المطوي في ثلاثة هياكل مختلفة. تم الحصول على ترتيب G-quadruplex ل TBA (G4-TBA) عن طريق طي قليل النوكليوتيد في BPE وفي وجود الكاتيون K + ، في حين تم طي ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing DNA G-Quadruplex by Bis-3-Chloropiperidine Based Chemical Mapping at JoVE.com

Bis-3-chloropiperidines (B-CePs) هي مجسات كيميائية مفيدة لتحديد وتوصيف هياكل G-quadruplex في قوالب الحمض النووي في المختبر. يفصل هذا البروتوكول الإجراء الخاص بإجراء تفاعلات التحقيق مع B-CePs وحل منتجات التفاعل عن طريق الرحلان الكهربائي عالي الدقة لهلام بولي أكريلاميد عالي الدقة.

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing ...

G-quadruplex هي هياكل ثانوية للحمض النووي تتشكل عادة داخل تتابعات الحمض النووي الغنية بالجوانين. يهدف رسم الخرائط الكيميائية ل G4 بواسطة B-CePs إلى توصيف G4 في المختبر ، ويسمح بتحديد الجوانين المحدد الذي يشكل G-tetrads. يعد تحديد G4s والتحقق التجريبي منها ضمن تسلسلات تشكيل G-quadruplex المحتملة مسألة ذات صلة بيولوجية ، والتي يتم تناولها حاليا بشكل أساسي من خلال الأدوات الحسابية.لدعم مثل هذه التنبؤات والكشف عن G4 غير المتوقع ، يمثل رسم الخرائط الكيميائية بواسطة B-CePs طريقة يمكن الوصول إليها لتحديد G4 في تسلسل الحمض النووي. يعد رسم الخرائط الكيميائية بواسطة B-CePs بديلا مناسبا لبروتوكول بصمة كبريتات ثنائي ميثيل المستخدم على نطاق واسع لتوصيف G-quadruplex. الميزة الرئيسية ل B-CePs هي أنه يقلل من عدد الخطوات في البروتوكول ويقلل من الكمية الأولية لركيزة الحمض النووي.يتم وصف رسم الخرائط الكيميائية بواسطة B-CePs هنا مع تسلسل TBA كدليل على المفهوم. سيؤدي البروتوكول إلى تجارب جديدة قابلة للتطبيق على أي تسلسل تشكيل G-quadruplex محتمل آخر يستكشف كلا من تركيبات الحمض النووي والحمض النووي الريبي.

في المختبر رسم الخرائط الكيميائية لهياكل الحمض النووي G-quadruplex بواسطة Bis-3-chloropiperidines

Abstract