עבודה זו נתמכה על ידי המחלקה למדעי התרופות והפרמקולוגיות, אוניברסיטת פדובה (PRIDJ-BIRD2019).

1. חומצת גרעין והכנת בדיקה כימית
<ol><li>חומצות גרעין הערה: אוליגונוקלאוטיד בשם "TBA" הוא רצף DNA של 15 מר 5'-GGT-TGG-TGT-GGT-TGG-3' המסומן בקצה 3' על ידי פלואורופור 5-carboxyfluorescein (FAM) כדי לאפשר הדמיה על הג'ל. האוליגונוקלאוטיד הבלתי מסומן "cTBA" הוא רצף הדנ"א המשלים שלו 5'-CCA-ACC-ACA-CCA-ACC-3'. TBA ו-cTBA משמשים להשגת שלו...

זיהוי G-Quadruplexes בתבנית DNA באמצעות מיפוי כימי

<ol>
	<li>Davis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-quartets+40+years+later:+from+5'-GMP+to+molecular+biology+and+supramolecular+chemistry.">G-quartets 40 years later: from 5'-GMP to molecular biology and supramolecular chemistry.</a> Angewandte Chemie. 43 (6), 668-698 (2004).</li><li>Varshney, D., Spiegel, J., Zyner, K., Tannahill, D., Balasubramanian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+and+functions+of+DNA+and+RNA+G-quadruplexes.">The regulation and functions of DNA and RNA G-quadruplexes.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (8), 459-474 (2020).</li><li>Chambers, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+sequencing+of+DNA+G-quadruplex+structures+in+the+human+genome.">High-throughput sequencing of DNA G-quadruplex structures in the human genome.</a> Nature Biotechnology. 33 (8), 877-881 (2015).</li><li>Zuravka, I., Sosic, A., Gatto, B., Gottlich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+evaluation+of+a+bis-3-chloropiperidine+derivative+incorporating+an+anthraquinone+pharmacophore.">Synthesis and evaluation of a bis-3-chloropiperidine derivative incorporating an anthraquinone pharmacophore.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 25 (20), 4606-4609 (2015).</li><li>Zuravka, I., Roesmann, R., Sosic, A., Gottlich, R., Gatto, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bis-3-chloropiperidines+containing+bridging+lysine+linkers:+Influence+of+side+chain+structure+on+DNA+alkylating+activity.">Bis-3-chloropiperidines containing bridging lysine linkers: Influence of side chain structure on DNA alkylating activity.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry. 23 (6), 1241-1250 (2015).</li><li>Zuravka, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+DNA+cleavage+activity+of+bis-3-chloropiperidines+as+alkylating+agents.">Synthesis and DNA cleavage activity of bis-3-chloropiperidines as alkylating agents.</a> ChemMedChem. 9 (9), 2178-2185 (2014).</li><li>Sosic, A., Gottlich, R., Fabris, D., Gatto, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-CePs+as+cross-linking+probes+for+the+investigation+of+RNA+higher-order+structure.">B-CePs as cross-linking probes for the investigation of RNA higher-order structure.</a> Nucleic Acids Research. 49 (12), 6660-6672 (2021).</li><li>Sosic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bis-3-chloropiperidines+targeting+TAR+RNA+as+a+novel+strategy+to+impair+the+HIV-1+nucleocapsid+protein.">Bis-3-chloropiperidines targeting TAR RNA as a novel strategy to impair the HIV-1 nucleocapsid protein.</a> Molecules. 26 (7), 1874 (2021).</li><li>Sosic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evaluation+of+bis-3-chloropiperidines+as+RNA+modulators+targeting+TAR+and+TAR-protein+interaction.">In vitro evaluation of bis-3-chloropiperidines as RNA modulators targeting TAR and TAR-protein interaction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (2), 582 (2022).</li><li>Sosic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+topoisomerase+II+mediated+DNA+damage+by+bis-3-chloropiperidines:+The+importance+of+being+an+earnest+G.">Direct and topoisomerase II mediated DNA damage by bis-3-chloropiperidines: The importance of being an earnest G.</a> ChemMedChem. 12 (17), 1471-1479 (2017).</li><li>Bock, L. C., Griffin, L. C., Latham, J. A., Vermaas, E. H., Toole, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+single-stranded+DNA+molecules+that+bind+and+inhibit+human+thrombin.">Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin.</a> Nature. 355 (6360), 564-566 (1992).</li><li>Paborsky, L. R., McCurdy, S. N., Griffin, L. C., Toole, J. J., Leung, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single-stranded+DNA+aptamer-binding+site+of+human+thrombin.">The single-stranded DNA aptamer-binding site of human thrombin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 268 (28), 20808-20811 (1993).</li><li>Carraro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behind+the+mirror:+chirality+tunes+the+reactivity+and+cytotoxicity+of+chloropiperidines+as+potential+anticancer+agents.">Behind the mirror: chirality tunes the reactivity and cytotoxicity of chloropiperidines as potential anticancer agents.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 10 (4), 552-557 (2019).</li><li>Carraro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appended+aromatic+moieties+in+flexible+bis-3-chloropiperidines+confer+tropism+against+pancreatic+cancer+cells.">Appended aromatic moieties in flexible bis-3-chloropiperidines confer tropism against pancreatic cancer cells.</a> ChemMedChem. 16 (5), 860-868 (2021).</li><li>Kypr, J., Kejnovska, I., Renciuk, D., Vorlickova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+dichroism+and+conformational+polymorphism+of+DNA.">Circular dichroism and conformational polymorphism of DNA.</a> Nucleic Acids Research. 37 (6), 1713-1725 (2009).</li><li>Onel, B., Wu, G., Sun, D., Lin, C., Yang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assay+and+dimethyl+sulfate+footprinting+for+characterization+of+G-quadruplexes+and+G-quadruplex-protein+complexes.">Electrophoretic mobility shift assay and dimethyl sulfate footprinting for characterization of G-quadruplexes and G-quadruplex-protein complexes.</a> Methods in Molecular Biology. 2035, 201-222 (2019).</li></ol>

G-quadruplexes הם מבנים משניים של חומצות גרעין המתקפלים בדרך כלל בתוך רצפי DNA עשירים בגואנין, והם מטרות מחקר משמעותיות בגלל הקשר שלהם עם בקרה גנטית ומחלות. מיפוי כימי על ידי B-CePs הוא פרוטוקול שימושי לאפיון DNA G4s, אשר יכול לשמש לזיהוי בסיסי גואנין המעורבים בהיווצרות G-tetrads בתנאי מלח פיזיולוגיים.
<p cl...

בנוסף לסליל הכפול הטיפוסי של ווטסון-קריק, חומצות גרעין יכולות לאמץ מבנים משניים שונים, כגון צורת G-quadruplex (G4) החלופית, בשל הרצפים העשירים בגואנין. מבנה G4 מבוסס על היווצרות טטרמרים מישוריים, הנקראים G-tetrads, שבהם ארבעה גואנינים מתקשרים באמצעות קשרי מימן Hoogsteen. G-tetrads מוערמים ומיוצבים עוד יותר על-ידי קטיונים חד-ערכיים המתואמים במרכז ליבת הגואנין (איור 1)1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65373/65373fig01.jpg"> איור 1: ייצוג סכמטי של מבנה G-quadruplex. (A) ייצוג סכמטי של G-tetrad. המערך המישורי מיוצב על ידי זיווג בסיס Hoogsteen ועל ידי קטיון מרכזי (M+). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65373/65373fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
רצפים עם ארבע ריצות או יותר של לפחות שני נוקלאוטידים עוקבים של גואנין הם רצפים פוטנציאליים יוצרי G-quadruplex (PQSs) שיכולים להתקפל במבני G-quadruplex. PQS ממוקמים בהקשרים תאיים רבים ושונים, כגון בטלומרים, מקדמי גנים, דנ"א ריבוזומלי ואתרי רקומבינציה, והם מעורבים בוויסות תהליכים ביולוגיים רבים2. לפיכך, הזיהוי והאימות הניסיוני של G4s בגנום האנושי, המבוצע כיום בעיקר באמצעות כלים חישוביים, הוא נושא רלוונטי מבחינה ביולוגית3. על מנת לתמוך בתחזיות חישוביות או לזהות מבני G4 בלתי צפויים, מוצגת כאן שיטה נגישה המבוססת על מיפוי כימי לזיהוי היווצרות G4 בתבנית DNA, המאפשרת זיהוי מדויק של גואנינים המרכיבים את מבנה G-tetrad.
בדיקת המיפוי הכימי המדווחת מנצלת את התגובתיות השונה של bis-3-chloropiperidines (B-CePs) עם גואנינים לאחר היווצרות מבני G4. בשל תגובתם הגבוהה לנוקלאופילים 4,5,6,7,8,9, B-CePs הם חומרים אלקילטים של חומצות גרעין עם היכולת להגיב ביעילות רבה עם מיקום N 7 של נוקלאוטידים גואנין10. אלקילציה מלווה בדפורינציה ובפיצול גדילים במבני DNA חד-גדיליים ודו-גדילים. נהפוך הוא, הגואנינים המעורבים בהיווצרות הטטרדות G בסידורי G4 אטומים לאלקילציה B-CeP, שכן מיקום N7 של גואנינים מעורב בקשרי המימן של Hoogsteen. תגובתיות ספציפית זו של B-CePs מאפשרת לא רק זיהוי של מבני G4, אלא גם זיהוי של הגואנינים המרכיבים את הטטרדים, כפי שניתן להסיק מהם מההגנה היחסית שלהם מפני אלקילציה בהשוואה לגואנינים בדנ"א חד-גדילי ודו-גדילי.
פרוטוקול המיפוי הכימי מדווח כאן באמצעות B-CeP 1 (איור 2A) כבדיקה לאפיון של אפטמר קושר טרומבין (TBA), דנ"א של 15 מר המסוגל להניח את סידור G4 בנוכחות קטיונים של אשלגן11,12. סידור G4 של TBA (G4-TBA) מושווה ישירות לשני פקדים, כלומר TBA בצורה חד-גדילית (ssTBA) ו-TBA מחושל לרצף המשלים שלו כדי ליצור את המבנה הדו-גדילי (dsTBA) (טבלה 1). תוצרים של תגובות חיטוט נפתרים על ידי אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד ברזולוציה גבוהה (PAGE) ברמת הנוקלאוטיד היחיד על ידי איתור צינורות אלקילציה בודדים ומחשוף גדילי DNA בגואנינים האלקילטים. הדמיה על הג'ל מתאפשרת על ידי הצמדה של אוליגונוקלאוטיד TBA עם פלואורופור בקצה 3 אינץ' שלו (טבלה 1). פרוטוקול זה מראה כיצד לקפל TBA בקונפורמציות השונות שלו (G4 ובקרות), וכיצד לבצע תגובות חיטוט עם B-CePs ואחריו PAGE.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylamide/bis-acrylamide solution 40%</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3658</td>
			<td>R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/ 
			24/25-62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium per-sulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>pbi international</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue Brilliant blue R</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B0149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-Sodium hydrogen phosphate dodecahydrate</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>71649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotides</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>synthesis of custom sequences</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>40248</td>
			<td>H351-360D-373</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imager</td>
			<td>GE Healtcare</td>
			<td>STORM B40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tubes 0.5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing apparatus</td>
			<td>Biometra</td>
			<td>Model S2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silanization solution I</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>85126</td>
			<td>H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>480086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speedvac concentrator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Savant DNA 120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>87689</td>
			<td>R11-21/22-23-34</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.08387.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>51456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Nanodrop 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro chemical mapping of g-quadruplex dna structures by bis-3-chloropiperidines

G-quadruplexes (G4s) הם מבני DNA רלוונטיים ביולוגית, לא קנוניים, הממלאים תפקיד חשוב בביטוי גנים ובמחלות, ומייצגים מטרות טיפוליות משמעותיות. נדרשות שיטות נגישות לאפיון במבחנה של DNA בתוך רצפים פוטנציאליים יוצרי G-quadruplex (PQS). B-CePs הם סוג של סוכני אלקילציה שהוכחו כבדיקות כימיות שימושיות לחקר המבנה מסדר גבוה יותר של חומצות גרעין. מאמר זה מתאר בדיקת מיפוי כימית חדשה המנצלת את התגובתיות הספציפית של B-CePs עם N7 של גואנינים, ואחריה פיצול גדילים ישיר ב-Gs האלקילציה. 
כלומר, כדי להבדיל בין קפלי G4 לבין צורות דנ"א פתוחות, אנו משתמשים ב-B-CeP 1 כדי לחקור את האפטמר קושר התרומבין (TBA), דנ"א של 15 מר המסוגל להניח את סידור G4. תגובה של גואנינים מגיבי B-CeP עם B-CeP 1 מניבה מוצרים שניתן לפתור על ידי אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד ברזולוציה גבוהה (PAGE) ברמת נוקלאוטיד יחיד על ידי איתור צינורות אלקילציה בודדים ומחשוף גדילי DNA בגואנינים האלקילטים. מיפוי באמצעות B-CePs הוא כלי פשוט ורב-עוצמה לאפיון במבחנה של רצפי DNA יוצרי G-quadruplex, המאפשר מיקום מדויק של גואנינים המעורבים בהיווצרות G-tetrads.

In addition to the typical Watson-Crick double helix, nucleic acids can adopt various secondary structures, such as the alternative G-quadruplex (G4) form, due to their guanine-rich sequences. G4 structure is based on the formation of planar tetramers, called G-tetrads, in which four guanines interact through Hoogsteen hydrogen bonds. G-tetrads are stacked and further stabilized by monovalent cations that are coordinated in the center of the guanine core (Figure 1)1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65373/65373fig01.jpg" /> 
Figure 1: Schematic representation of a G-quadruplex structure. (A) Schematic representation of a G-tetrad. The planar array is stabilized by Hoogsteen base-pairing and by a central cation (M+).&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65373/65373fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Sequences with four or more runs of at least two consecutive guanine nucleotides are potential G-quadruplex-forming sequences (PQSs) that can fold in G-quadruplex structures. PQSs are located in many different cellular contexts, such as at telomeres, gene promoters, ribosomal DNA, and recombination sites, and are involved in the regulation of many biological processes2. Hence, the identification and experimental validation of G4s in the human genome, which is currently performed primarily through computational tools, is a biologically relevant issue3. In order to support computational predictions or detect unpredicted G4 structures, an accessible method based on chemical mapping to identify the G4 formation in a DNA template is shown here, enabling the precise identification of guanines forming the G-tetrad structure.
The reported chemical mapping assay exploits the different reactivity of bis-3-chloropiperidines (B-CePs) with guanines following the formation of G4 structures. Due to their high reactivity with nucleophiles4,5,6,7,8,9, B-CePs are nucleic acid-alkylating agents with the ability to react very efficiently with the N7 position of guanine nucleotides10. Alkylation is followed by depurination and strand cleavage in single- and double-stranded DNA constructs. On the contrary, guanines involved in the formation of the G-tetrads in G4 arrangements are impervious to B-CeP alkylation, as the N7 position of guanines is implicated in the Hoogsteen hydrogen bonds. This specific reactivity of B-CePs allows not only the detection of G4 structures, but also the identification of the guanines forming the tetrad(s), as they can be deduced from their relative protection from alkylation compared with guanines in single- and double-stranded DNA.
The chemical mapping protocol is reported here using B-CeP 1 (Figure 2A) as a probe for the characterization of thrombin-binding aptamer (TBA), a 15-mer DNA able to assume the G4 arrangement in the presence of potassium cations11,12. The G4 arrangement of TBA (G4-TBA) is directly compared with two controls, namely TBA in the single-stranded form (ssTBA) and TBA annealed to its complementary sequence to form the double-stranded construct (dsTBA) (Table 1). Products of probing reactions are resolved by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) at the single-nucleotide level by locating individual alkylation adducts and DNA strand cleavage at the alkylated guanines. Visualization on the gel is enabled by conjugation of the TBA oligonucleotide with a fluorophore at its 3&#39;-end (Table 1). This protocol shows how to fold TBA in its different conformations (G4 and controls), and how to perform probing reactions with B-CePs followed by PAGE.

מחבר זרקור: אפיון DNA G-Quadruplex על ידי מיפוי כימי מבוסס Bis-3-Chloropiperidine 

במבחנה מיפוי כימי של מבני DNA G-Quadruplex על ידי bis-3-chloropiperidines

G-quadruplex are nucleic acid secondary structures that typically formed within guanine-rich DNA sequences. The chemical mapping of G4 by B-CePs aims at the in vitro characterization of G4, and allows the identification of the specific guanines forming the G-tetrads. The identification and the experimental validation of G4s within potential G-quadruplex-forming sequences is a biologically relevant issue, which is currently addressed primary through computational tools.To support such predictions and detect the unpredicted G4, chemical mapping by B-CePs represents an accessible method to identify G4 in DNA sequences. The chemical mapping by B-CePs is a convenient alternative to the widely used dimethyl sulfate footprinting protocol for the characterization of G-quadruplex. The key advantage by B-CePs is that it reduces the number of steps in the protocol and it reduces the initial amount of the DNA substrate.The chemical mapping by B-CePs is described here with the TBA sequence as a proof of concept. The protocol will lead to new experiments applicable to any other potential G-quadruplex-forming sequence exploring both DNA and RNA constructs.

איור 2 מראה תוצאה מייצגת של בדיקת מיפוי כימי שבוצעה, כפי שמתואר בפרוטוקול עם B-CeP 1 על אוליגונוקלאוטיד TBA המקופל בשלושה מבנים שונים. סידור G-quadruplex של TBA (G4-TBA) התקבל על ידי קיפול האוליגונוקלאוטיד ב-BPE ובנוכחות קטיון K+, בעוד שהצורה החד-גדילית של אותו רצף TBA (ssTBA) קופלה בהיעדר א?...

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing DNA G-Quadruplex by Bis-3-Chloropiperidine Based Chemical Mapping at JoVE.com

Bis-3-chloropiperidines (B-CePs) הן בדיקות כימיות שימושיות לזיהוי ואפיון מבני G-quadruplex בתבניות DNA במבחנה. פרוטוקול זה מפרט את ההליך לביצוע תגובות חיטוט עם B-CePs ולפתרון תוצרי תגובה על ידי אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד ברזולוציה גבוהה.

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing ...

G-quadruplex הם מבנים משניים של חומצות גרעין שנוצרו בדרך כלל בתוך רצפי DNA עשירים בגואנין. המיפוי הכימי של G4 על ידי B-CePs מכוון לאפיון חוץ גופי של G4, ומאפשר זיהוי של הגואנינים הספציפיים המרכיבים את הטטרדות G. הזיהוי והאימות הניסיוני של G4s בתוך רצפים פוטנציאליים של יצירת G-quadruplex הוא נושא רלוונטי מבחינה ביולוגית, אשר מטופל כיום בעיקר באמצעות כלים חישוביים.כדי לתמוך בתחזיות כאלה ולזהות את G4 הבלתי צפוי, מיפוי כימי על ידי B-CePs מייצג שיטה נגישה לזיהוי G4 ברצפי DNA. המיפוי הכימי על ידי B-CePs הוא חלופה נוחה לפרוטוקול טביעת הרגל הדימתיל סולפט הנפוץ לאפיון G-quadruplex. היתרון העיקרי של B-CePs הוא שהוא מפחית את מספר השלבים בפרוטוקול והוא מפחית את הכמות הראשונית של מצע ה- DNA.המיפוי הכימי של B-CePs מתואר כאן עם רצף TBA כהוכחת היתכנות. הפרוטוקול יוביל לניסויים חדשים החלים על כל רצף פוטנציאלי אחר ליצירת G-quadruplex, שיחקרו הן את מבני הדנ"א והן את מבני הרנ"א.

במבחנה מיפוי כימי של מבני DNA G-Quadruplex על ידי bis-3-chloropiperidines

Abstract