A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Бис-3-хлорпиперидины (B-CeP) являются полезными химическими зондами для идентификации и характеристики структур G-квадруплекса в матрицах ДНК in vitro. В этом протоколе подробно описана процедура проведения зондирующих реакций с B-CeP и растворения продуктов реакции с помощью электрофореза в полиакриламидном геле высокого разрешения.
G-квадруплексы (G4) — это биологически значимые, неканонические структуры ДНК, которые играют важную роль в экспрессии генов и заболеваниях, представляя собой важные терапевтические мишени. Для характеристики ДНК in vitro в потенциальных G-квадруплекс-образующих последовательностях (PQS) требуются доступные методы. B-CeP — это класс алкилирующих агентов, которые оказались полезными химическими зондами для исследования структуры нуклеиновых кислот высшего порядка. В данной работе описывается новый химический картирующий анализ, использующий специфическую реакционную способность B-CeP с N7 гуанинов с последующим прямым расщеплением цепей в алкилированных Gs.
А именно, чтобы отличить складки G4 от развернутых форм ДНК, мы используем B-CeP 1 для зондирования тромбин-связывающего аптамера (TBA), 15-мерной ДНК, способной принимать расположение G4. Реакция B-CeP-реагирующих гуанинов с B-CeP 1 дает продукты, которые могут быть разрешены с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE) высокого разрешения на однонуклеотидном уровне путем локализации отдельных аддуктов алкилирования и расщепления цепей ДНК на алкилированных гуанинах. Картирование с использованием B-CePs является простым и мощным инструментом для характеристики in vitro последовательностей ДНК, образующих G-квадруплекс, что позволяет точно определить местоположение гуанинов, участвующих в образовании G-тетрад.
В дополнение к типичной двойной спирали Уотсона-Крика, нуклеиновые кислоты могут принимать различные вторичные структуры, такие как альтернативная форма G-квадруплекса (G4), из-за их богатых гуанином последовательностей. Структура G4 основана на образовании плоских тетрамеров, называемых G-тетрадами, в которых четыре гуанина взаимодействуют через водородные связи Хугстина. G-тетрады укладываются друг на друга и дополнительно стабилизируются одновалентными катионами, которые координируются в центре гуанинового ядра (рис. 1)1.
1. Подготовка нуклеиновых кислот и химических зондов
На рисунке 2 показан репрезентативный результат проведенного химического картирования, как описано в протоколе, с B-CeP 1 на олигонуклеотиде TBA, свернутом в три различные структуры. TG-квадруплексное расположение TBA (G4-TBA) было получено путем сворачивания олигонуклеотида в BP.......
G-квадруплексы представляют собой вторичные структуры нуклеиновых кислот, которые обычно сворачиваются в богатых гуанином последовательностях ДНК и являются важными объектами исследований из-за их связи с генетическим контролем и заболеваниями. Химическое картирование с помощью B-CeP.......
Эта работа была поддержана Департаментом фармацевтических и фармакологических наук Университета Падуи (PRIDJ-BIRD2019).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Acrylamide/bis-acrylamide solution 40% | Applichem | A3658 | R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/ 24/25-62 |
Ammonium per-sulfate (APS) | Sigma Aldrich | A7460 | |
Analytical balance | Mettler Toledo | ||
Autoclave | pbi international | ||
Boric acid | Sigma Aldrich | B0252 | |
Bromophenol blue Brilliant blue R | Sigma Aldrich | B0149 | |
di-Sodium hydrogen phosphate dodecahydrate | Fluka | 71649 | |
DMSO | Sigma Aldrich | 276855 | |
DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | synthesis of custom sequences | |
EDTA disodium | Sigma Aldrich | E5134 | |
Formamide | Fluka | 40248 | H351-360D-373 |
Gel imager | GE Healtcare | STORM B40 | |
Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
Micro tubes 0.5 mL | Sarstedt | 72.704 | |
Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
Sequencing apparatus | Biometra | Model S2 | |
Silanization solution I | Fluka | 85126 | H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410 |
Sodium phosphate monobasic | Carlo Erba | 480086 | |
Speedvac concentrator | Thermo Scientific | Savant DNA 120 | |
TEMED | Fluka | 87689 | R11-21/22-23-34 |
Tris-HCl | MERCK | 1.08387.2500 | |
Urea | Sigma Aldrich | 51456 | |
UV-Vis spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved