Detta arbete stöddes av Institutionen för farmaceutiska och farmakologiska vetenskaper, University of Padova (PRIDJ-BIRD2019).

1. Beredning av nukleinsyra och kemisk sond
<ol><li>Nukleinsyror OBS: Oligonukleotiden med namnet "TBA" är 15-mer DNA-sekvensen 5'-GGT-TGG-TGT-GGT-TGG-3' märkt i 3'-änden av fluoroforen 5-karboxyfluorescein (FAM) för att möjliggöra visualisering på gelen. Den omärkta oligonukleotiden "cTBA" är dess DNA-komplementära sekvens 5'-CCA-ACC-ACA-CCA-ACC-3'. TBA och cTBA används för att erhålla de tre olika strukturerna, som visas i tabell 1.<ol><li>Autoklavspetsar och 0,5 ml r...

Identifiera G-quadruplexer i en DNA-mall med hjälp av kemisk kartläggning

<ol>
	<li>Davis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-quartets+40+years+later:+from+5'-GMP+to+molecular+biology+and+supramolecular+chemistry.">G-quartets 40 years later: from 5'-GMP to molecular biology and supramolecular chemistry.</a> Angewandte Chemie. 43 (6), 668-698 (2004).</li><li>Varshney, D., Spiegel, J., Zyner, K., Tannahill, D., Balasubramanian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+and+functions+of+DNA+and+RNA+G-quadruplexes.">The regulation and functions of DNA and RNA G-quadruplexes.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (8), 459-474 (2020).</li><li>Chambers, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+sequencing+of+DNA+G-quadruplex+structures+in+the+human+genome.">High-throughput sequencing of DNA G-quadruplex structures in the human genome.</a> Nature Biotechnology. 33 (8), 877-881 (2015).</li><li>Zuravka, I., Sosic, A., Gatto, B., Gottlich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+evaluation+of+a+bis-3-chloropiperidine+derivative+incorporating+an+anthraquinone+pharmacophore.">Synthesis and evaluation of a bis-3-chloropiperidine derivative incorporating an anthraquinone pharmacophore.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 25 (20), 4606-4609 (2015).</li><li>Zuravka, I., Roesmann, R., Sosic, A., Gottlich, R., Gatto, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bis-3-chloropiperidines+containing+bridging+lysine+linkers:+Influence+of+side+chain+structure+on+DNA+alkylating+activity.">Bis-3-chloropiperidines containing bridging lysine linkers: Influence of side chain structure on DNA alkylating activity.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry. 23 (6), 1241-1250 (2015).</li><li>Zuravka, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+DNA+cleavage+activity+of+bis-3-chloropiperidines+as+alkylating+agents.">Synthesis and DNA cleavage activity of bis-3-chloropiperidines as alkylating agents.</a> ChemMedChem. 9 (9), 2178-2185 (2014).</li><li>Sosic, A., Gottlich, R., Fabris, D., Gatto, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-CePs+as+cross-linking+probes+for+the+investigation+of+RNA+higher-order+structure.">B-CePs as cross-linking probes for the investigation of RNA higher-order structure.</a> Nucleic Acids Research. 49 (12), 6660-6672 (2021).</li><li>Sosic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bis-3-chloropiperidines+targeting+TAR+RNA+as+a+novel+strategy+to+impair+the+HIV-1+nucleocapsid+protein.">Bis-3-chloropiperidines targeting TAR RNA as a novel strategy to impair the HIV-1 nucleocapsid protein.</a> Molecules. 26 (7), 1874 (2021).</li><li>Sosic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evaluation+of+bis-3-chloropiperidines+as+RNA+modulators+targeting+TAR+and+TAR-protein+interaction.">In vitro evaluation of bis-3-chloropiperidines as RNA modulators targeting TAR and TAR-protein interaction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (2), 582 (2022).</li><li>Sosic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+topoisomerase+II+mediated+DNA+damage+by+bis-3-chloropiperidines:+The+importance+of+being+an+earnest+G.">Direct and topoisomerase II mediated DNA damage by bis-3-chloropiperidines: The importance of being an earnest G.</a> ChemMedChem. 12 (17), 1471-1479 (2017).</li><li>Bock, L. C., Griffin, L. C., Latham, J. A., Vermaas, E. H., Toole, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+single-stranded+DNA+molecules+that+bind+and+inhibit+human+thrombin.">Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin.</a> Nature. 355 (6360), 564-566 (1992).</li><li>Paborsky, L. R., McCurdy, S. N., Griffin, L. C., Toole, J. J., Leung, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single-stranded+DNA+aptamer-binding+site+of+human+thrombin.">The single-stranded DNA aptamer-binding site of human thrombin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 268 (28), 20808-20811 (1993).</li><li>Carraro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behind+the+mirror:+chirality+tunes+the+reactivity+and+cytotoxicity+of+chloropiperidines+as+potential+anticancer+agents.">Behind the mirror: chirality tunes the reactivity and cytotoxicity of chloropiperidines as potential anticancer agents.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 10 (4), 552-557 (2019).</li><li>Carraro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appended+aromatic+moieties+in+flexible+bis-3-chloropiperidines+confer+tropism+against+pancreatic+cancer+cells.">Appended aromatic moieties in flexible bis-3-chloropiperidines confer tropism against pancreatic cancer cells.</a> ChemMedChem. 16 (5), 860-868 (2021).</li><li>Kypr, J., Kejnovska, I., Renciuk, D., Vorlickova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+dichroism+and+conformational+polymorphism+of+DNA.">Circular dichroism and conformational polymorphism of DNA.</a> Nucleic Acids Research. 37 (6), 1713-1725 (2009).</li><li>Onel, B., Wu, G., Sun, D., Lin, C., Yang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assay+and+dimethyl+sulfate+footprinting+for+characterization+of+G-quadruplexes+and+G-quadruplex-protein+complexes.">Electrophoretic mobility shift assay and dimethyl sulfate footprinting for characterization of G-quadruplexes and G-quadruplex-protein complexes.</a> Methods in Molecular Biology. 2035, 201-222 (2019).</li></ol>

G-quadruplexer är nukleinsyrasekundära strukturer som vanligtvis veckar sig inom guaninrika DNA-sekvenser och är viktiga forskningsmål på grund av deras koppling till genetisk kontroll och sjukdomar. Kemisk kartläggning med B-CePs är ett användbart protokoll för karakterisering av DNA G4s, som kan användas för att identifiera guaninbaserna som är involverade i bildandet av G-tetrader under fysiologiska saltförhållanden.
Den kemiska sond som används i detta protokoll är B-CeP 1 ...

Förutom den typiska Watson-Crick-dubbelhelixen kan nukleinsyror anta olika sekundära strukturer, såsom den alternativa G-quadruplex-formen (G4), på grund av deras guaninrika sekvenser. G4-strukturen är baserad på bildandet av plana tetramerer, kallade G-tetrader, där fyra guaniner interagerar genom Hoogsteen vätebindningar. G-tetrader staplas och stabiliseras ytterligare av monovalenta katjoner som samordnas i mitten av guaninkärnan (figur 1)1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65373/65373fig01.jpg"> Figur 1: Schematisk representation av en G-quadruplexstruktur. (A) Schematisk representation av en G-tetrad. Den plana matrisen stabiliseras av Hoogsteen-basparning och av en central katjon (M+). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65373/65373fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
Sekvenser med fyra eller fler körningar av minst två på varandra följande guaninnukleotider är potentiella G-quadruplex-bildande sekvenser (PQS) som kan veckas i G-quadruplexstrukturer. PQS finns i många olika cellulära sammanhang, såsom vid telomerer, genpromotorer, ribosomalt DNA och rekombinationsställen, och är involverade i regleringen av många biologiska processer2. Därför är identifiering och experimentell validering av G4s i det mänskliga genomet, som för närvarande främst utförs genom beräkningsverktyg, en biologiskt relevant fråga3. För att stödja beräkningsförutsägelser eller upptäcka oförutsedda G4-strukturer visas här en tillgänglig metod baserad på kemisk kartläggning för att identifiera G4-bildningen i en DNA-mall, vilket möjliggör exakt identifiering av guaniner som bildar G-tetradstrukturen.
Den rapporterade kemiska kartläggningsanalysen utnyttjar den olika reaktiviteten hos bis-3-kloropiperidiner (B-CePs) med guaniner efter bildandet av G4-strukturer. På grund av sin höga reaktivitet med nukleofiler 4,5,6,7,8,9 är B-CeP nukleinsyraalkylerande medel med förmågan att reagera mycket effektivt med N7-positionen hos guaninnukleotider 10. Alkylering följs av avurinering och strängklyvning i enkel- och dubbelsträngade DNA-konstruktioner. Tvärtom är guaniner som är involverade i bildandet av G-tetraderna i G4-arrangemang ogenomträngliga för B-CeP-alkylering, eftersom guaninernas N7-positionär inblandad i Hoogsteen-vätebindningarna. Denna specifika reaktivitet hos B-CePs möjliggör inte bara detektion av G4-strukturer, utan också identifiering av de guaniner som bildar tetraden eller tetraderna, eftersom de kan härledas från deras relativa skydd mot alkylering jämfört med guaniner i enkel- och dubbelsträngat DNA.
Det kemiska kartläggningsprotokollet rapporteras här med användning av B-CeP 1 (Figur 2A) som en sond för karakterisering av trombinbindande aptamer (TBA), ett 15-mer-DNA som kan anta G4-arrangemanget i närvaro av kaliumkatjoner11,12. G4-arrangemanget av TBA (G4-TBA) jämförs direkt med två kontroller, nämligen TBA i enkelsträngad form (ssTBA) och TBA glödgad till sin komplementära sekvens för att bilda den dubbelsträngade konstruktionen (dsTBA) (tabell 1). Produkter av sonderande reaktioner löses upp med högupplösande polyakrylamidgelelektrofores (PAGE) på enkelnukleotidnivå genom att lokalisera enskilda alkyleringsaddukter och DNA-strängklyvning vid de alkylerade guaninerna. Visualisering på gelen möjliggörs genom konjugering av TBA-oligonukleotiden med en fluorofor i dess 3'-ände (tabell 1). Detta protokoll visar hur man viker TBA i dess olika konformationer (G4 och kontroller), och hur man utför sonderingsreaktioner med B-CePs följt av PAGE.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylamide/bis-acrylamide solution 40%</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3658</td>
			<td>R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/ 
			24/25-62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium per-sulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>pbi international</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue Brilliant blue R</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B0149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-Sodium hydrogen phosphate dodecahydrate</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>71649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotides</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>synthesis of custom sequences</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>40248</td>
			<td>H351-360D-373</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imager</td>
			<td>GE Healtcare</td>
			<td>STORM B40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tubes 0.5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing apparatus</td>
			<td>Biometra</td>
			<td>Model S2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silanization solution I</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>85126</td>
			<td>H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>480086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speedvac concentrator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Savant DNA 120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>87689</td>
			<td>R11-21/22-23-34</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.08387.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>51456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Nanodrop 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro chemical mapping of g-quadruplex dna structures by bis-3-chloropiperidines

G-quadruplexer (G4s) är biologiskt relevanta, icke-kanoniska DNA-strukturer som spelar en viktig roll i genuttryck och sjukdomar, och representerar betydande terapeutiska mål. Tillgängliga metoder krävs för in vitro-karakterisering av DNA inom potentiella G-quadruplex-bildande sekvenser (PQS). B-CePs är en klass av alkylerande medel som har visat sig vara användbara kemiska sonder för undersökning av nukleinsyrors högre ordningsstruktur. Denna artikel beskriver en ny kemisk kartläggningsanalys som utnyttjar den specifika reaktiviteten hos B-CePs med N7 av guaniner, följt av direkt strängklyvning vid de alkylerade Gs. 
För att skilja G4-veck från ovikta DNA-former använder vi nämligen B-CeP 1 för att undersöka den trombinbindande aptameren (TBA), ett 15-mer-DNA som kan anta G4-arrangemanget. Reaktion mellan B-CeP-reagerande guaniner och B-CeP 1 ger produkter som kan lösas upp genom högupplösande polyakrylamidgelelektrofores (PAGE) på en enda nukleotidnivå genom att lokalisera enskilda alkyleringsaddukter och DNA-strängklyvning vid de alkylerade guaninerna. Kartläggning med hjälp av B-CePs är ett enkelt och kraftfullt verktyg för in vitro-karakterisering av G-quadruplex-bildande DNA-sekvenser, vilket möjliggör exakt lokalisering av guaniner som är involverade i bildandet av G-tetrader.

In addition to the typical Watson-Crick double helix, nucleic acids can adopt various secondary structures, such as the alternative G-quadruplex (G4) form, due to their guanine-rich sequences. G4 structure is based on the formation of planar tetramers, called G-tetrads, in which four guanines interact through Hoogsteen hydrogen bonds. G-tetrads are stacked and further stabilized by monovalent cations that are coordinated in the center of the guanine core (Figure 1)1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65373/65373fig01.jpg" /> 
Figure 1: Schematic representation of a G-quadruplex structure. (A) Schematic representation of a G-tetrad. The planar array is stabilized by Hoogsteen base-pairing and by a central cation (M+).&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65373/65373fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Sequences with four or more runs of at least two consecutive guanine nucleotides are potential G-quadruplex-forming sequences (PQSs) that can fold in G-quadruplex structures. PQSs are located in many different cellular contexts, such as at telomeres, gene promoters, ribosomal DNA, and recombination sites, and are involved in the regulation of many biological processes2. Hence, the identification and experimental validation of G4s in the human genome, which is currently performed primarily through computational tools, is a biologically relevant issue3. In order to support computational predictions or detect unpredicted G4 structures, an accessible method based on chemical mapping to identify the G4 formation in a DNA template is shown here, enabling the precise identification of guanines forming the G-tetrad structure.
The reported chemical mapping assay exploits the different reactivity of bis-3-chloropiperidines (B-CePs) with guanines following the formation of G4 structures. Due to their high reactivity with nucleophiles4,5,6,7,8,9, B-CePs are nucleic acid-alkylating agents with the ability to react very efficiently with the N7 position of guanine nucleotides10. Alkylation is followed by depurination and strand cleavage in single- and double-stranded DNA constructs. On the contrary, guanines involved in the formation of the G-tetrads in G4 arrangements are impervious to B-CeP alkylation, as the N7 position of guanines is implicated in the Hoogsteen hydrogen bonds. This specific reactivity of B-CePs allows not only the detection of G4 structures, but also the identification of the guanines forming the tetrad(s), as they can be deduced from their relative protection from alkylation compared with guanines in single- and double-stranded DNA.
The chemical mapping protocol is reported here using B-CeP 1 (Figure 2A) as a probe for the characterization of thrombin-binding aptamer (TBA), a 15-mer DNA able to assume the G4 arrangement in the presence of potassium cations11,12. The G4 arrangement of TBA (G4-TBA) is directly compared with two controls, namely TBA in the single-stranded form (ssTBA) and TBA annealed to its complementary sequence to form the double-stranded construct (dsTBA) (Table 1). Products of probing reactions are resolved by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) at the single-nucleotide level by locating individual alkylation adducts and DNA strand cleavage at the alkylated guanines. Visualization on the gel is enabled by conjugation of the TBA oligonucleotide with a fluorophore at its 3&#39;-end (Table 1). This protocol shows how to fold TBA in its different conformations (G4 and controls), and how to perform probing reactions with B-CePs followed by PAGE.

Författare i fokus: Karakterisering av DNA G-Quadruplex genom Bis-3-klorpiperidinbaserad kemisk kartläggning 

In vitro Kemisk kartläggning av G-Quadruplex DNA-strukturer med Bis-3-kloropiperidiner

G-quadruplex are nucleic acid secondary structures that typically formed within guanine-rich DNA sequences. The chemical mapping of G4 by B-CePs aims at the in vitro characterization of G4, and allows the identification of the specific guanines forming the G-tetrads. The identification and the experimental validation of G4s within potential G-quadruplex-forming sequences is a biologically relevant issue, which is currently addressed primary through computational tools.To support such predictions and detect the unpredicted G4, chemical mapping by B-CePs represents an accessible method to identify G4 in DNA sequences. The chemical mapping by B-CePs is a convenient alternative to the widely used dimethyl sulfate footprinting protocol for the characterization of G-quadruplex. The key advantage by B-CePs is that it reduces the number of steps in the protocol and it reduces the initial amount of the DNA substrate.The chemical mapping by B-CePs is described here with the TBA sequence as a proof of concept. The protocol will lead to new experiments applicable to any other potential G-quadruplex-forming sequence exploring both DNA and RNA constructs.

Figur 2 visar ett representativt resultat av en kemisk kartläggningsanalys utförd, enligt beskrivningen i protokollet med B-CeP 1 på TBA-oligonukleotiden veckad i tre olika strukturer. G-quadruplex-arrangemanget av TBA (G4-TBA) erhölls genom att vecka oligonukleotiden i BPE och i närvaro av K+-katjonen, medan den enkelsträngade formen av samma TBA-sekvens (ssTBA) veckades i frånvaro av kalium. Den dubbelsträngade konstruktionen (dsTBA) framställdes genom att glödga TBA t...

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing DNA G-Quadruplex by Bis-3-Chloropiperidine Based Chemical Mapping at JoVE.com

Bis-3-kloropiperidiner (B-CePs) är användbara kemiska prober för att identifiera och karakterisera G-quadruplex-strukturer i DNA-mallar in vitro. Detta protokoll beskriver proceduren för att utföra sonderande reaktioner med B-CePs och för att lösa reaktionsprodukter genom högupplösande polyakrylamidgelelektrofores.

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing ...

G-quadruplex är nukleinsyrasekundära strukturer som vanligtvis bildas inom guaninrika DNA-sekvenser. Den kemiska kartläggningen av G4 med B-CePs syftar till in vitro-karakterisering av G4 och möjliggör identifiering av de specifika guaniner som bildar G-tetraderna. Identifiering och experimentell validering av G4s inom potentiella G-quadruplex-bildande sekvenser är en biologiskt relevant fråga, som för närvarande hanteras primärt genom beräkningsverktyg.För att stödja sådana förutsägelser och upptäcka den oförutsedda G4 representerar kemisk kartläggning med B-CePs en tillgänglig metod för att identifiera G4 i DNA-sekvenser. Den kemiska kartläggningen av B-CePs är ett bekvämt alternativ till det allmänt använda dimetylsulfatfotavtrycksprotokollet för karakterisering av G-quadruplex. Den viktigaste fördelen med B-CePs är att det minskar antalet steg i protokollet och det minskar den initiala mängden DNA-substrat.Den kemiska kartläggningen av B-CePs beskrivs här med TBA-sekvensen som ett proof of concept. Protokollet kommer att leda till nya experiment som är tillämpliga på alla andra potentiella G-quadruplex-bildande sekvenser som utforskar både DNA- och RNA-konstruktioner.

in-vitro-chemical-mapping-g-quadruplex-dna-structures-bis-3

In vitro Kemisk kartläggning av G-Quadruplex DNA-strukturer med Bis-3-kloropiperidiner

Abstract