מדידת צריכת O2 בדרוזופילה מלנוגסטר באמצעות מיקרו-רספירומטריה קולומטרית

Summary

ספירומטריה קולומטרית אידיאלית למדידת קצב חילוף החומרים של אורגניזמים קטנים. כאשר הותאם עבור Drosophila melanogaster במחקר הנוכחי, צריכת O₂ שנמדדה הייתה בטווח שדווח עבור סוג בר D. melanogaster על ידי מחקרים קודמים. צריכת O₂ לכל זבוב על ידי מוטנטים של ASK שהם קטנים יותר ופעילים פחות, הייתה נמוכה משמעותית מזו של ה-wildtype .

Abstract

מיקרו-רספירומטריה קולומטרית היא שיטה פשוטה וזולה למדידת צריכת O₂ של אורגניזמים קטנים תוך שמירה על סביבה יציבה. מיקרו-רספירומטר קולומטרי מורכב מתא אטום שבו O 2 נצרך וה- CO₂ המיוצר על ידי האורגניזם מוסר על ידי מדיום סופג. ירידת הלחץ כתוצאה מכך מפעילה ייצור אלקטרוליטי O 2, וכמות O₂ המיוצרת נמדדת על ידי רישום כמות המטען המשמש ליצירתו. במחקר הנוכחי הותאמה השיטה לדרוזופילה מלנוגסטר שנבדקה בקבוצות קטנות, כאשר רגישות המכשיר ותנאי הסביבה מותאמים ליציבות גבוהה. כמות O₂ הנצרכת על ידי זבובי בר במנגנון זה עקבית עם זו שנמדדה על ידי מחקרים קודמים. צריכת O₂ ספציפית למסה על ידי מוטנטים של TASK, שהם קטנים יותר וידועים כפחות פעילים, לא הייתה שונה מקבוצת ביקורת קונגנית. עם זאת, הגודל הקטן של מוטנטים CASK הביא לירידה משמעותית בצריכת O₂ על בסיס זבוב. לכן, המיקרו-רספירומטר מסוגל למדוד את צריכת O₂ ב-D. melanogaster, יכול להבחין בהבדלים צנועים בין גנוטיפים, ומוסיף כלי רב-תכליתי למדידת קצב חילוף החומרים.

Introduction

היכולת למדוד קצב חילוף חומרים חיונית להבנה מלאה של אורגניזם בהקשר הסביבתי שלו. לדוגמה, יש צורך למדוד את קצב חילוף החומרים כדי להבין את תפקידו בתוחלת החיים¹, את תפקיד הדיאטה בחילוף החומרים², או את הסף ללחץ היפוקסי³.

ישנן שתי גישות כלליות למדידת קצב חילוף החומרים⁴. קלורימטריה ישירה מודדת את הוצאת האנרגיה ישירות על ידי מדידת ייצור חום. קלורימטריה עקיפה מודדת את ייצור האנרגיה באמצעים אחרים, לעתים קרובות באמצעות מדידה ספירומטרית של צריכת O 2 (V_O2), ייצור CO₂ או שניהם. למרות שקלורימטריה ישירה יושמה על אקטורמות קטנות, כו....

Protocol

1. גידול ואיסוף זבובים

1. יש לשמור על זבובים בטמפרטורה של 25°C בבקבוקונים צרים המכילים מזון דרוזופילה סטנדרטי.
   הערה: גודל הדגימה עבור כל גנוטיפ צריך לכלול לפחות תשעה עותקים משוכפלים, שכל אחד מהם מורכב מתא רספירומטר יחיד המכיל 15-25 זבובים, המוגדרים כמתואר להלן.
2. מעבירים ?.......

Discussion

ההליך לעיל מדגים מדידה של צריכת O₂ ב- D. Melanogaster באמצעות מיקרו-רספירומטר קולומטרי אלקטרוני. הנתונים שהתקבלו עבור צריכת O₂ במלנוגסטר מסוג D פראי היו בטווח שתואר ברוב הפרסומים הקודמים בשיטות מגוונות (טבלה 1), אם כי נמוכים במקצת מאלה שדווחו על ידי אחרים ^3,6

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
19/22 Thermometer Adapter	Wilmad-Labglass	ML-280-702	Sensor Plug
2 ml Screwcap Tubes	Fisher	3464	O2 generator
2-Pin Connector	Zyamy	40PIN-RFB10	O2 generator: cut to 2-pin
4-Pin Female Connector	TE Connectivity	215299-4	Sensor Plug
5 ml Polypropylene Tube	Falcon	352063	Cut to 5.5 cm and perforated
50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint	Laboy	HMF050804	Chamber
6-Conductor Cable	Zenith	6-Conductor 26 ga	Cable
6-Pin Female Bulkhead Connector	Switchcraft	17982-6SG-300	Controller
6-Pin Female Connector	Switchcraft	18982-6SG-522	Sensor plug
6-Pin Male Connector	Switchcraft	16982-6PG-522	Cable
800 ul centrifuge tube	Fisher	05-408-120	Soda Lime Cartridge
ABS Plastic Enclosure	Bud Industries	PS-11533-G	Controller
Arduino Nano Every	Arduino LLC	ABX00028	Controller
BME 280 Sensor	DIYMall	FZ1639-BME280	Sensor Plug
Circuit Board	Lheng	5 X 7 cm	Controller
Copper Sulfate	BioPharm	BC2045	O2 Generator
Computer	Azulle	Byte4	Data Acquisition
Cotton Rolls	Kajukajudo	#2	Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity
Environmental Chamber	Percival	I30 VLC8	Fly Care
Epoxy	JB Weld	Plastic Bonder	Secure Electrodes in O2 Generator
Fly Food	Lab Express	Type R	Fly Care
Keck Clamps	uxcell	a20092300ux0418	Secures glass joint of chamber to plug
Low-Viscosity Epoxy	Loctite	E-30CL	Sensor Plug
OLED Display	IZOKEE	IZKE31-IIC-WH-3	Controller
Platinum Wire 24 ga	uGems	14349	O2 generator
Silicone grease	Dow-Corning	High Vacuum Grease	Seals chamber-plug connection
Soda Lime	Jorvet	JO553	CO2 absorption
Toggle Switch	E-Switch	100SP1T1B1M1QEH	Controller
USB Cable	Sabrent	CB-UM63	Controller
USB Hub	Atolla	Hub 3.0	Connect controllers to computer
Water bath	Amersham	56-1165-33	Temperature Control
Water Bath Tank	Glass Cages	15-liter rimless acrylic	Bath for Respirometers