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La respirometria coulometrica è ideale per misurare il tasso metabolico di piccoli organismi. Quando è stato adattato per Drosophila melanogaster nel presente studio, il consumo di O2 misurato era all'interno dell'intervallo riportato per D. melanogaster selvatico da studi precedenti. Il consumo di O2 per mosca da parte dei mutanti CASK , che sono più piccoli e meno attivi, è stato significativamente inferiore rispetto al wildtype.
La microrespirometria coulometrica è un metodo semplice ed economico per misurare il consumo di O2 di piccoli organismi mantenendo un ambiente stabile. Un microrespirometro coulometrico è costituito da una camera ermetica in cui l'O 2 viene consumato e la CO2 prodotta dall'organismo viene rimossa da un mezzo assorbente. La diminuzione di pressione risultante innesca la produzione elettrolitica di O 2 e la quantità di O2 prodotta viene misurata registrando la quantità di carica utilizzata per generarlo. Nel presente studio, il metodo è stato adattato a Drosophila melanogaster testato in piccoli gruppi, con la sensibilità dell'apparato e le condizioni ambientali ottimizzate per un'elevata stabilità. La quantità di O2 consumata dalle mosche selvatiche in questo apparato è coerente con quella misurata da studi precedenti. Il consumo di O2 specifico per la massa da parte dei mutanti CASK, che sono più piccoli e noti per essere meno attivi, non era diverso dai controlli congeniti. Tuttavia, le piccole dimensioni dei mutanti CASK hanno portato a una significativa riduzione del consumo di O2 su base per mosca. Pertanto, il microrespirometro è in grado di misurare il consumo di O2 in D. melanogaster, è in grado di distinguere modeste differenze tra i genotipi e aggiunge uno strumento versatile per misurare i tassi metabolici.
La capacità di misurare il tasso metabolico è fondamentale per una comprensione completa di un organismo nel suo contesto ambientale. Ad esempio, è necessario misurare il tasso metabolico per comprendere il suo ruolo nella durata della vita1, il ruolo della dieta nel metabolismo2 o la soglia per lo stress ipossico3.
Esistono due approcci generali per misurare il tasso metabolico4. La calorimetria diretta misura il dispendio energetico direttamente misurando la produzione di calore. La calorimetria indiretta misura la produzione di energia con alt....
1. Allevamento e raccolta delle mosche
Le uscite di pressione e corrente del controller del respirometro sono mostrate per una camera in un esperimento nella Figura 3A. Il primo, lungo impulso di corrente ha pressurizzato la camera dalla pressione ambiente (circa 992 hPa) alla soglia OFF preimpostata di 1017 hPa. Man mano che le mosche consumavano O 2 e la CO 2 veniva assorbita, la pressione diminuiva lentamente fino a raggiungere la soglia ON di 1016 hPa, che attivava la corrente attraverso il generatore di O2
La procedura di cui sopra mostra la misurazione del consumo di O2 in D. melanogaster utilizzando un microrespirometro coulometrico elettronico. I dati risultanti per il consumo di O2 in D. melanogaster wild-type erano all'interno degli intervalli descritti nella maggior parte delle pubblicazioni precedenti utilizzando metodi diversi (Tabella 1), anche se leggermente inferiori a quelli riportati da altri 3,6.
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamo la Dott.ssa Linda Restifo dell'Università dell'Arizona per aver suggerito di testare il consumo di O2 dei mutanti CASK e per l'invio dei mutanti CASK e dei loro controlli congeniti. Le spese di pubblicazione sono state fornite dal Fondo di reinvestimento dipartimentale del Dipartimento di Biologia dell'Università di College Park. Lo spazio e alcune attrezzature sono stati forniti dalle Università di Shady Grove.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
19/22 Thermometer Adapter | Wilmad-Labglass | ML-280-702 | Sensor Plug |
2 ml Screwcap Tubes | Fisher | 3464 | O2 generator |
2-Pin Connector | Zyamy | 40PIN-RFB10 | O2 generator: cut to 2-pin |
4-Pin Female Connector | TE Connectivity | 215299-4 | Sensor Plug |
5 ml Polypropylene Tube | Falcon | 352063 | Cut to 5.5 cm and perforated |
50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint | Laboy | HMF050804 | Chamber |
6-Conductor Cable | Zenith | 6-Conductor 26 ga | Cable |
6-Pin Female Bulkhead Connector | Switchcraft | 17982-6SG-300 | Controller |
6-Pin Female Connector | Switchcraft | 18982-6SG-522 | Sensor plug |
6-Pin Male Connector | Switchcraft | 16982-6PG-522 | Cable |
800 ul centrifuge tube | Fisher | 05-408-120 | Soda Lime Cartridge |
ABS Plastic Enclosure | Bud Industries | PS-11533-G | Controller |
Arduino Nano Every | Arduino LLC | ABX00028 | Controller |
BME 280 Sensor | DIYMall | FZ1639-BME280 | Sensor Plug |
Circuit Board | Lheng | 5 X 7 cm | Controller |
Copper Sulfate | BioPharm | BC2045 | O2 Generator |
Computer | Azulle | Byte4 | Data Acquisition |
Cotton Rolls | Kajukajudo | #2 | Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity |
Environmental Chamber | Percival | I30 VLC8 | Fly Care |
Epoxy | JB Weld | Plastic Bonder | Secure Electrodes in O2 Generator |
Fly Food | Lab Express | Type R | Fly Care |
Keck Clamps | uxcell | a20092300ux0418 | Secures glass joint of chamber to plug |
Low-Viscosity Epoxy | Loctite | E-30CL | Sensor Plug |
OLED Display | IZOKEE | IZKE31-IIC-WH-3 | Controller |
Platinum Wire 24 ga | uGems | 14349 | O2 generator |
Silicone grease | Dow-Corning | High Vacuum Grease | Seals chamber-plug connection |
Soda Lime | Jorvet | JO553 | CO2 absorption |
Toggle Switch | E-Switch | 100SP1T1B1M1QEH | Controller |
USB Cable | Sabrent | CB-UM63 | Controller |
USB Hub | Atolla | Hub 3.0 | Connect controllers to computer |
Water bath | Amersham | 56-1165-33 | Temperature Control |
Water Bath Tank | Glass Cages | 15-liter rimless acrylic | Bath for Respirometers |
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