Misurazione del consumo di O2 in Drosophila melanogaster mediante microrespirometria coulometrica

Summary

La respirometria coulometrica è ideale per misurare il tasso metabolico di piccoli organismi. Quando è stato adattato per Drosophila melanogaster nel presente studio, il consumo di O₂ misurato era all'interno dell'intervallo riportato per D. melanogaster selvatico da studi precedenti. Il consumo di O₂ per mosca da parte dei mutanti CASK , che sono più piccoli e meno attivi, è stato significativamente inferiore rispetto al wildtype.

Abstract

La microrespirometria coulometrica è un metodo semplice ed economico per misurare il consumo di O₂ di piccoli organismi mantenendo un ambiente stabile. Un microrespirometro coulometrico è costituito da una camera ermetica in cui l'O 2 viene consumato e la CO₂ prodotta dall'organismo viene rimossa da un mezzo assorbente. La diminuzione di pressione risultante innesca la produzione elettrolitica di O 2 e la quantità di O₂ prodotta viene misurata registrando la quantità di carica utilizzata per generarlo. Nel presente studio, il metodo è stato adattato a Drosophila melanogaster testato in piccoli gruppi, con la sensibilità dell'apparato e le condizioni ambientali ottimizzate per un'elevata stabilità. La quantità di O₂ consumata dalle mosche selvatiche in questo apparato è coerente con quella misurata da studi precedenti. Il consumo di O₂ specifico per la massa da parte dei mutanti CASK, che sono più piccoli e noti per essere meno attivi, non era diverso dai controlli congeniti. Tuttavia, le piccole dimensioni dei mutanti CASK hanno portato a una significativa riduzione del consumo di O₂ su base per mosca. Pertanto, il microrespirometro è in grado di misurare il consumo di O₂ in D. melanogaster, è in grado di distinguere modeste differenze tra i genotipi e aggiunge uno strumento versatile per misurare i tassi metabolici.

Introduction

La capacità di misurare il tasso metabolico è fondamentale per una comprensione completa di un organismo nel suo contesto ambientale. Ad esempio, è necessario misurare il tasso metabolico per comprendere il suo ruolo nella durata della vita¹, il ruolo della dieta nel metabolismo² o la soglia per lo stress ipossico³.

Esistono due approcci generali per misurare il tasso metabolico⁴. La calorimetria diretta misura il dispendio energetico direttamente misurando la produzione di calore. La calorimetria indiretta misura la produzione di energia con alt....

Protocol

1. Allevamento e raccolta delle mosche

1. Mantenere le mosche a 25 °C in flaconcini stretti contenenti cibo standard per Drosophila .
   NOTA: La dimensione del campione per ciascun genotipo deve comprendere almeno nove repliche, ciascuna costituita da una singola camera respirometrica contenente 15-25 moscerini, configurati come descritto di seguito.
2. Trasferisci le mosche ogni 2-3 giorni.
3. Anestetizzare le mosche con CO₂, raccogliere gruppi di 15-25 maschi .......

Discussion

La procedura di cui sopra mostra la misurazione del consumo di O₂ in D. melanogaster utilizzando un microrespirometro coulometrico elettronico. I dati risultanti per il consumo di O₂ in D. melanogaster wild-type erano all'interno degli intervalli descritti nella maggior parte delle pubblicazioni precedenti utilizzando metodi diversi (Tabella 1), anche se leggermente inferiori a quelli riportati da altri ^3,6.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
19/22 Thermometer Adapter	Wilmad-Labglass	ML-280-702	Sensor Plug
2 ml Screwcap Tubes	Fisher	3464	O2 generator
2-Pin Connector	Zyamy	40PIN-RFB10	O2 generator: cut to 2-pin
4-Pin Female Connector	TE Connectivity	215299-4	Sensor Plug
5 ml Polypropylene Tube	Falcon	352063	Cut to 5.5 cm and perforated
50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint	Laboy	HMF050804	Chamber
6-Conductor Cable	Zenith	6-Conductor 26 ga	Cable
6-Pin Female Bulkhead Connector	Switchcraft	17982-6SG-300	Controller
6-Pin Female Connector	Switchcraft	18982-6SG-522	Sensor plug
6-Pin Male Connector	Switchcraft	16982-6PG-522	Cable
800 ul centrifuge tube	Fisher	05-408-120	Soda Lime Cartridge
ABS Plastic Enclosure	Bud Industries	PS-11533-G	Controller
Arduino Nano Every	Arduino LLC	ABX00028	Controller
BME 280 Sensor	DIYMall	FZ1639-BME280	Sensor Plug
Circuit Board	Lheng	5 X 7 cm	Controller
Copper Sulfate	BioPharm	BC2045	O2 Generator
Computer	Azulle	Byte4	Data Acquisition
Cotton Rolls	Kajukajudo	#2	Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity
Environmental Chamber	Percival	I30 VLC8	Fly Care
Epoxy	JB Weld	Plastic Bonder	Secure Electrodes in O2 Generator
Fly Food	Lab Express	Type R	Fly Care
Keck Clamps	uxcell	a20092300ux0418	Secures glass joint of chamber to plug
Low-Viscosity Epoxy	Loctite	E-30CL	Sensor Plug
OLED Display	IZOKEE	IZKE31-IIC-WH-3	Controller
Platinum Wire 24 ga	uGems	14349	O2 generator
Silicone grease	Dow-Corning	High Vacuum Grease	Seals chamber-plug connection
Soda Lime	Jorvet	JO553	CO2 absorption
Toggle Switch	E-Switch	100SP1T1B1M1QEH	Controller
USB Cable	Sabrent	CB-UM63	Controller
USB Hub	Atolla	Hub 3.0	Connect controllers to computer
Water bath	Amersham	56-1165-33	Temperature Control
Water Bath Tank	Glass Cages	15-liter rimless acrylic	Bath for Respirometers