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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

La respirometria coulometrica è ideale per misurare il tasso metabolico di piccoli organismi. Quando è stato adattato per Drosophila melanogaster nel presente studio, il consumo di O2 misurato era all'interno dell'intervallo riportato per D. melanogaster selvatico da studi precedenti. Il consumo di O2 per mosca da parte dei mutanti CASK , che sono più piccoli e meno attivi, è stato significativamente inferiore rispetto al wildtype.

Abstract

La microrespirometria coulometrica è un metodo semplice ed economico per misurare il consumo di O2 di piccoli organismi mantenendo un ambiente stabile. Un microrespirometro coulometrico è costituito da una camera ermetica in cui l'O 2 viene consumato e la CO2 prodotta dall'organismo viene rimossa da un mezzo assorbente. La diminuzione di pressione risultante innesca la produzione elettrolitica di O 2 e la quantità di O2 prodotta viene misurata registrando la quantità di carica utilizzata per generarlo. Nel presente studio, il metodo è stato adattato a Drosophila melanogaster testato in piccoli gruppi, con la sensibilità dell'apparato e le condizioni ambientali ottimizzate per un'elevata stabilità. La quantità di O2 consumata dalle mosche selvatiche in questo apparato è coerente con quella misurata da studi precedenti. Il consumo di O2 specifico per la massa da parte dei mutanti CASK, che sono più piccoli e noti per essere meno attivi, non era diverso dai controlli congeniti. Tuttavia, le piccole dimensioni dei mutanti CASK hanno portato a una significativa riduzione del consumo di O2 su base per mosca. Pertanto, il microrespirometro è in grado di misurare il consumo di O2 in D. melanogaster, è in grado di distinguere modeste differenze tra i genotipi e aggiunge uno strumento versatile per misurare i tassi metabolici.

Introduction

La capacità di misurare il tasso metabolico è fondamentale per una comprensione completa di un organismo nel suo contesto ambientale. Ad esempio, è necessario misurare il tasso metabolico per comprendere il suo ruolo nella durata della vita1, il ruolo della dieta nel metabolismo2 o la soglia per lo stress ipossico3.

Esistono due approcci generali per misurare il tasso metabolico4. La calorimetria diretta misura il dispendio energetico direttamente misurando la produzione di calore. La calorimetria indiretta misura la produzione di energia con alt....

Protocol

1. Allevamento e raccolta delle mosche

  1. Mantenere le mosche a 25 °C in flaconcini stretti contenenti cibo standard per Drosophila .
    NOTA: La dimensione del campione per ciascun genotipo deve comprendere almeno nove repliche, ciascuna costituita da una singola camera respirometrica contenente 15-25 moscerini, configurati come descritto di seguito.
  2. Trasferisci le mosche ogni 2-3 giorni.
  3. Anestetizzare le mosche con CO2, raccogliere gruppi di 15-25 maschi .......

Representative Results

Le uscite di pressione e corrente del controller del respirometro sono mostrate per una camera in un esperimento nella Figura 3A. Il primo, lungo impulso di corrente ha pressurizzato la camera dalla pressione ambiente (circa 992 hPa) alla soglia OFF preimpostata di 1017 hPa. Man mano che le mosche consumavano O 2 e la CO 2 veniva assorbita, la pressione diminuiva lentamente fino a raggiungere la soglia ON di 1016 hPa, che attivava la corrente attraverso il generatore di O2

Discussion

La procedura di cui sopra mostra la misurazione del consumo di O2 in D. melanogaster utilizzando un microrespirometro coulometrico elettronico. I dati risultanti per il consumo di O2 in D. melanogaster wild-type erano all'interno degli intervalli descritti nella maggior parte delle pubblicazioni precedenti utilizzando metodi diversi (Tabella 1), anche se leggermente inferiori a quelli riportati da altri 3,6.

Acknowledgements

Ringraziamo la Dott.ssa Linda Restifo dell'Università dell'Arizona per aver suggerito di testare il consumo di O2 dei mutanti CASK e per l'invio dei mutanti CASK e dei loro controlli congeniti. Le spese di pubblicazione sono state fornite dal Fondo di reinvestimento dipartimentale del Dipartimento di Biologia dell'Università di College Park. Lo spazio e alcune attrezzature sono stati forniti dalle Università di Shady Grove.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
19/22 Thermometer AdapterWilmad-LabglassML-280-702Sensor Plug
2 ml Screwcap TubesFisher3464O2 generator
2-Pin ConnectorZyamy40PIN-RFB10O2 generator: cut to 2-pin
4-Pin Female ConnectorTE Connectivity215299-4Sensor Plug
5 ml Polypropylene TubeFalcon352063Cut to 5.5 cm and perforated 
50 ml Schlenk Tube 19/22 JointLaboyHMF050804Chamber
6-Conductor CableZenith6-Conductor 26 gaCable
6-Pin Female Bulkhead ConnectorSwitchcraft17982-6SG-300Controller
6-Pin Female ConnectorSwitchcraft18982-6SG-522Sensor plug
6-Pin Male ConnectorSwitchcraft16982-6PG-522Cable
800 ul centrifuge tubeFisher05-408-120Soda Lime Cartridge
ABS Plastic EnclosureBud IndustriesPS-11533-GController
Arduino Nano EveryArduino LLCABX00028Controller
BME 280 SensorDIYMallFZ1639-BME280Sensor Plug
Circuit BoardLheng5 X 7 cmController
Copper SulfateBioPharmBC2045O2 Generator
ComputerAzulleByte4Data Acquisition
Cotton RollsKajukajudo#2Cut in half to plug fly tubes
Cut in quarters for humidity
Environmental ChamberPercivalI30 VLC8Fly Care
EpoxyJB WeldPlastic BonderSecure Electrodes in O2 Generator
Fly FoodLab ExpressType RFly Care
Keck Clampsuxcella20092300ux0418Secures glass joint of chamber to plug
Low-Viscosity EpoxyLoctiteE-30CLSensor Plug
OLED DisplayIZOKEEIZKE31-IIC-WH-3Controller
Platinum Wire 24 gauGems14349O2 generator
Silicone greaseDow-CorningHigh Vacuum GreaseSeals chamber-plug connection
Soda LimeJorvetJO553CO2 absorption
Toggle SwitchE-Switch100SP1T1B1M1QEHController
USB CableSabrentCB-UM63Controller
USB HubAtollaHub 3.0Connect controllers to computer
Water bathAmersham56-1165-33Temperature Control
Water Bath TankGlass Cages15-liter rimless acrylicBath for Respirometers

References

  1. Arking, R., Buck, S., Wells, R. A., Pretzlaff, R. Metabolic rates in genetically based long lived strains of Drosophila. Experimental Gerontology. 23 (1), 59-76 (1988).
  2. Henry, Y., Overgaard, J., Colinet, H.

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