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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

A respirometria coulométrica é ideal para medir a taxa metabólica de pequenos organismos. Quando adaptado para Drosophila melanogaster no presente estudo, o consumo medido de O2 estava dentro da faixa relatada para D. melanogaster selvagem por estudos anteriores. O consumo por mosca O2 pelos mutantes CAS , que são menores e menos ativos, foi significativamente menor do que o selvagem.

Abstract

A microrrespirometria coulométrica é um método simples e barato para medir o consumo de O2 de pequenos organismos, mantendo um ambiente estável. Um microrrespirômetro coulométrico consiste em uma câmara hermética na qual o O 2 é consumido e o CO2 produzido pelo organismo é removido por um meio absorvente. A diminuição de pressão resultante desencadeia a produção eletrolítica de O 2, e a quantidade de O2 produzida é medida registrando-se a quantidade de carga usada para gerá-la. No presente estudo, o método foi adaptado para Drosophila melanogaster testado em pequenos grupos, com a sensibilidade do aparelho e as condições ambientais otimizadas para alta estabilidade. A quantidade de O2 consumida por moscas selvagens neste aparelho é consistente com a medida por estudos anteriores. O consumo deO2 específico em massa pelos mutantes CARSK, que são menores e sabidamente menos ativos, não foi diferente dos controles congênicos. No entanto, o pequeno tamanho dos mutantes CASK resultou em uma redução significativa no consumo de O2 por mosca. Portanto, o microrrespirômetro é capaz de medir o consumo de O2 em D. melanogaster, pode distinguir diferenças modestas entre genótipos e adiciona uma ferramenta versátil para medir taxas metabólicas.

Introduction

A capacidade de medir a taxa metabólica é crucial para uma compreensão completa de um organismo em seu contexto ambiental. Por exemplo, é necessário medir a taxa metabólica para entender seu papel no tempo de vida1, o papel da dieta no metabolismo2 ou o limiar para o estresse hipóxico3.

Existem duas abordagens gerais para medir a taxa metabólica4. A calorimetria direta mede o gasto energético diretamente medindo a produção de calor. A calorimetria indireta mede a produção de energia por outros meios, muitas vezes por meio da medição respirométric....

Protocol

1. Criação e coleta de moscas

  1. Manter as moscas a 25 °C em frascos para injetáveis estreitos contendo alimentos padrão de Drosophila .
    NOTA: O tamanho da amostra para cada genótipo deve incluir pelo menos nove repetições, cada uma consistindo de uma única câmara respiratória contendo 15-25 moscas, configuradas conforme descrito abaixo.
  2. Transfira as moscas a cada 2-3 dias.
  3. Anestesiar moscas com CO2, coletar grupos de 15-25 machos de cada genó.......

Representative Results

As saídas de pressão e corrente do controlador do respirômetro são mostradas para uma câmara em um experimento na Figura 3A. O primeiro pulso de corrente longa pressurizou a câmara da pressão ambiente (aproximadamente 992 hPa) até o limiar OFF pré-estabelecido de 1017 hPa. À medida que as moscas consumiam O 2 e CO 2 era absorvido, a pressão diminuía lentamente até atingir o limiar de ON de 1016 hPa, que ativava a corrente através do gerador de O2.

Discussion

O procedimento acima demonstra a medição do consumo de O2 em D. Melanogaster usando um microrrespirômetro coulométrico eletrônico. Os dados resultantes para o consumo de O2 em D. melanogaster selvagem estavam dentro dos intervalos descritos na maioria das publicações anteriores usando diversos métodos (Tabela 1), embora um pouco menores do que os relatados por outros 3,6.

Acknowledgements

Agradecemos à Dra. Linda Restifo da Universidade do Arizona por sugerir testar o consumo de O2 de mutantes CASK e por enviar mutantes CASK e seus controles congênicos. As taxas de publicação foram fornecidas pelo Fundo de Reinvestimento Departamental do Departamento de Biologia da Universidade de College Park. O espaço e alguns equipamentos foram fornecidos pelas Universidades de Shady Grove.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
19/22 Thermometer AdapterWilmad-LabglassML-280-702Sensor Plug
2 ml Screwcap TubesFisher3464O2 generator
2-Pin ConnectorZyamy40PIN-RFB10O2 generator: cut to 2-pin
4-Pin Female ConnectorTE Connectivity215299-4Sensor Plug
5 ml Polypropylene TubeFalcon352063Cut to 5.5 cm and perforated 
50 ml Schlenk Tube 19/22 JointLaboyHMF050804Chamber
6-Conductor CableZenith6-Conductor 26 gaCable
6-Pin Female Bulkhead ConnectorSwitchcraft17982-6SG-300Controller
6-Pin Female ConnectorSwitchcraft18982-6SG-522Sensor plug
6-Pin Male ConnectorSwitchcraft16982-6PG-522Cable
800 ul centrifuge tubeFisher05-408-120Soda Lime Cartridge
ABS Plastic EnclosureBud IndustriesPS-11533-GController
Arduino Nano EveryArduino LLCABX00028Controller
BME 280 SensorDIYMallFZ1639-BME280Sensor Plug
Circuit BoardLheng5 X 7 cmController
Copper SulfateBioPharmBC2045O2 Generator
ComputerAzulleByte4Data Acquisition
Cotton RollsKajukajudo#2Cut in half to plug fly tubes
Cut in quarters for humidity
Environmental ChamberPercivalI30 VLC8Fly Care
EpoxyJB WeldPlastic BonderSecure Electrodes in O2 Generator
Fly FoodLab ExpressType RFly Care
Keck Clampsuxcella20092300ux0418Secures glass joint of chamber to plug
Low-Viscosity EpoxyLoctiteE-30CLSensor Plug
OLED DisplayIZOKEEIZKE31-IIC-WH-3Controller
Platinum Wire 24 gauGems14349O2 generator
Silicone greaseDow-CorningHigh Vacuum GreaseSeals chamber-plug connection
Soda LimeJorvetJO553CO2 absorption
Toggle SwitchE-Switch100SP1T1B1M1QEHController
USB CableSabrentCB-UM63Controller
USB HubAtollaHub 3.0Connect controllers to computer
Water bathAmersham56-1165-33Temperature Control
Water Bath TankGlass Cages15-liter rimless acrylicBath for Respirometers

References

  1. Arking, R., Buck, S., Wells, R. A., Pretzlaff, R. Metabolic rates in genetically based long lived strains of Drosophila. Experimental Gerontology. 23 (1), 59-76 (1988).
  2. Henry, Y., Overgaard, J., Colinet, H.

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