Mensuração do Consumo de O2 em Drosophila melanogaster Utilizando Microrrespirometria Coulométrica

Summary

A respirometria coulométrica é ideal para medir a taxa metabólica de pequenos organismos. Quando adaptado para Drosophila melanogaster no presente estudo, o consumo medido de O₂ estava dentro da faixa relatada para D. melanogaster selvagem por estudos anteriores. O consumo por mosca O₂ pelos mutantes CAS , que são menores e menos ativos, foi significativamente menor do que o selvagem.

Abstract

A microrrespirometria coulométrica é um método simples e barato para medir o consumo de O₂ de pequenos organismos, mantendo um ambiente estável. Um microrrespirômetro coulométrico consiste em uma câmara hermética na qual o O 2 é consumido e o CO₂ produzido pelo organismo é removido por um meio absorvente. A diminuição de pressão resultante desencadeia a produção eletrolítica de O 2, e a quantidade de O₂ produzida é medida registrando-se a quantidade de carga usada para gerá-la. No presente estudo, o método foi adaptado para Drosophila melanogaster testado em pequenos grupos, com a sensibilidade do aparelho e as condições ambientais otimizadas para alta estabilidade. A quantidade de O₂ consumida por moscas selvagens neste aparelho é consistente com a medida por estudos anteriores. O consumo de_O2 específico em massa pelos mutantes CARSK, que são menores e sabidamente menos ativos, não foi diferente dos controles congênicos. No entanto, o pequeno tamanho dos mutantes CASK resultou em uma redução significativa no consumo de O₂ por mosca. Portanto, o microrrespirômetro é capaz de medir o consumo de O₂ em D. melanogaster, pode distinguir diferenças modestas entre genótipos e adiciona uma ferramenta versátil para medir taxas metabólicas.

Introduction

A capacidade de medir a taxa metabólica é crucial para uma compreensão completa de um organismo em seu contexto ambiental. Por exemplo, é necessário medir a taxa metabólica para entender seu papel no tempo de vida¹, o papel da dieta no metabolismo² ou o limiar para o estresse hipóxico³.

Existem duas abordagens gerais para medir a taxa metabólica⁴. A calorimetria direta mede o gasto energético diretamente medindo a produção de calor. A calorimetria indireta mede a produção de energia por outros meios, muitas vezes por meio da medição respirométric....

Protocol

1. Criação e coleta de moscas

1. Manter as moscas a 25 °C em frascos para injetáveis estreitos contendo alimentos padrão de Drosophila .
   NOTA: O tamanho da amostra para cada genótipo deve incluir pelo menos nove repetições, cada uma consistindo de uma única câmara respiratória contendo 15-25 moscas, configuradas conforme descrito abaixo.
2. Transfira as moscas a cada 2-3 dias.
3. Anestesiar moscas com CO₂, coletar grupos de 15-25 machos de cada genó.......

Discussion

O procedimento acima demonstra a medição do consumo de O₂ em D. Melanogaster usando um microrrespirômetro coulométrico eletrônico. Os dados resultantes para o consumo de O₂ em D. melanogaster selvagem estavam dentro dos intervalos descritos na maioria das publicações anteriores usando diversos métodos (Tabela 1), embora um pouco menores do que os relatados por outros ^3,6.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
19/22 Thermometer Adapter	Wilmad-Labglass	ML-280-702	Sensor Plug
2 ml Screwcap Tubes	Fisher	3464	O2 generator
2-Pin Connector	Zyamy	40PIN-RFB10	O2 generator: cut to 2-pin
4-Pin Female Connector	TE Connectivity	215299-4	Sensor Plug
5 ml Polypropylene Tube	Falcon	352063	Cut to 5.5 cm and perforated
50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint	Laboy	HMF050804	Chamber
6-Conductor Cable	Zenith	6-Conductor 26 ga	Cable
6-Pin Female Bulkhead Connector	Switchcraft	17982-6SG-300	Controller
6-Pin Female Connector	Switchcraft	18982-6SG-522	Sensor plug
6-Pin Male Connector	Switchcraft	16982-6PG-522	Cable
800 ul centrifuge tube	Fisher	05-408-120	Soda Lime Cartridge
ABS Plastic Enclosure	Bud Industries	PS-11533-G	Controller
Arduino Nano Every	Arduino LLC	ABX00028	Controller
BME 280 Sensor	DIYMall	FZ1639-BME280	Sensor Plug
Circuit Board	Lheng	5 X 7 cm	Controller
Copper Sulfate	BioPharm	BC2045	O2 Generator
Computer	Azulle	Byte4	Data Acquisition
Cotton Rolls	Kajukajudo	#2	Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity
Environmental Chamber	Percival	I30 VLC8	Fly Care
Epoxy	JB Weld	Plastic Bonder	Secure Electrodes in O2 Generator
Fly Food	Lab Express	Type R	Fly Care
Keck Clamps	uxcell	a20092300ux0418	Secures glass joint of chamber to plug
Low-Viscosity Epoxy	Loctite	E-30CL	Sensor Plug
OLED Display	IZOKEE	IZKE31-IIC-WH-3	Controller
Platinum Wire 24 ga	uGems	14349	O2 generator
Silicone grease	Dow-Corning	High Vacuum Grease	Seals chamber-plug connection
Soda Lime	Jorvet	JO553	CO2 absorption
Toggle Switch	E-Switch	100SP1T1B1M1QEH	Controller
USB Cable	Sabrent	CB-UM63	Controller
USB Hub	Atolla	Hub 3.0	Connect controllers to computer
Water bath	Amersham	56-1165-33	Temperature Control
Water Bath Tank	Glass Cages	15-liter rimless acrylic	Bath for Respirometers