Arizona Üniversitesi'nden Dr. Linda Restifo'ya CASK mutantlarınınO2 tüketimini test etmeyi önerdiği ve CASK mutantlarını ve onların konjenik kontrollerini gönderdiği için teşekkür ederiz. Yayın ücretleri, College Park Üniversitesi Biyoloji Bölümü'nden Bölüm Yeniden Yatırım Fonu tarafından sağlandı. Uzay ve bazı ekipmanlar Shady Grove'daki Üniversiteler tarafından sağlandı.

1. Sinek yetiştirme ve toplama
<ol><li>Sinekleri 25 °C'de standart Drosophila gıdası içeren dar şişelerde muhafaza edin. NOT: Her genotip için numune büyüklüğü, her biri aşağıda açıklandığı gibi kurulmuş 15-25 sinek içeren tek bir respirometre odasından oluşan en az dokuz kopyadan oluşmalıdır.</li>
	<li>Sinekleri 2-3 günde bir aktarın.</li>
	<li>CO2 ile sinekleri uyuşturun, her genotipten 15-25 erkekten oluşan grupları toplayın ve her grubu taze,...

Adapting Microrespirometry for Drosophila - Insights into CASK Mutant Metabolism

<ol>
	<li>Arking, R., Buck, S., Wells, R. A., Pretzlaff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+rates+in+genetically+based+long+lived+strains+of+Drosophila.">Metabolic rates in genetically based long lived strains of Drosophila.</a> Experimental Gerontology. 23 (1), 59-76 (1988).</li><li>Henry, Y., Overgaard, J., Colinet, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+nutrient+balance+shapes+phenotypic+traits+of+Drosophila+melanogaster+in+interaction+with+gut+microbiota.">Dietary nutrient balance shapes phenotypic traits of Drosophila melanogaster in interaction with gut microbiota.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular &amp; Integrative Physiology. 241, 110626 (2020).</li><li>Burggren, W., Souder, B. M., Ho, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+rate+and+hypoxia+tolerance+are+affected+by+group+interactions+and+sex+in+the+fruit+fly+(Drosophila+melanogaster):+new+data+and+a+literature+survey.">Metabolic rate and hypoxia tolerance are affected by group interactions and sex in the fruit fly (Drosophila melanogaster): new data and a literature survey.</a> Biology Open. 6, 471-480 (2017).</li><li>Lighton, J. R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Measuring Metabolic Rates. , (2019).</li><li>Fiorino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallelized,+real-time,+metabolic-rate+measurements+from+individual+Drosophila.">Parallelized, real-time, metabolic-rate measurements from individual Drosophila.</a> Scientific Reports. 8 (1), 14452 (2018).</li><li>Berrigan, D., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+temperature+and+activity+on+the+rate+of+adult+Drosophila+melanogaster.">Influence of temperature and activity on the rate of adult Drosophila melanogaster.</a> Comparative Biochemistry and Physiology. 118 (4), 1301-1307 (1997).</li><li>Hulbert, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+rate+is+not+reduced+by+dietary-restriction+or+by+lowered+insulin/IGF-1+signalling+and+is+not+correlated+with+individual+lifespan+in+Drosophila+melanogaster.">Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster.</a> Experimental Gerontology. 39 (8), 1137-1143 (2004).</li><li>Botero, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofibromin+regulates+metabolic+rate+via+neuronal+mechanisms+in+Drosophila.">Neurofibromin regulates metabolic rate via neuronal mechanisms in Drosophila.</a> Nature Communications. 12 (1), 4285 (2021).</li><li>Yatsenko, A. S., Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Shcherbata, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Metabolic+Rate+in+Drosophila+using+Respirometry.">Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 51681 (2014).</li><li>Ross, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-specific+decrease+in+aerobic+efficiency+associated+with+increase+in+oxygen+free+radical+production+in+Drosophila+melanogaster.">Age-specific decrease in aerobic efficiency associated with increase in oxygen free radical production in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Insect Physiology. 46 (11), 1477-1480 (2000).</li><li>Brown, E. B., Klok, J., Keene, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+metabolic+rate+in+single+flies+during+sleep+and+waking+states+via+indirect+calorimetry.">Measuring metabolic rate in single flies during sleep and waking states via indirect calorimetry.</a> Journal of Neuroscience Methods. 376, 109606 (2022).</li><li>Sandstrom, D. J., Offord, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+oxygen+consumption+in+Tenebrio+molitor+using+a+sensitive,+inexpensive,+sensor-based+coulometric+microrespirometer.">Measurement of oxygen consumption in Tenebrio molitor using a sensitive, inexpensive, sensor-based coulometric microrespirometer.</a> Journal of Experimental Biology. 225 (9), jeb243966 (2022).</li><li>Becker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+dysfunction+in+CASK-related+neurodevelopmental+disorders.">Presynaptic dysfunction in CASK-related neurodevelopmental disorders.</a> Translational Psychiatry. 10 (1), 312 (2020).</li><li>Slawson, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Regulation+of+Locomotor+Behavior+of+Drosophila+melanogaster+Depends+on+a+CASK+Isoform+Containing+CaMK-Like+and+L27+Domains.">Central Regulation of Locomotor Behavior of Drosophila melanogaster Depends on a CASK Isoform Containing CaMK-Like and L27 Domains.</a> Genetics. 187 (1), 171-184 (2011).</li><li>Slawson, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+dopamine+release+by+CASK-&#206;2+modulates+locomotor+initiation+in+Drosophila+melanogaster.">Regulation of dopamine release by CASK-&#206;2 modulates locomotor initiation in Drosophila melanogaster.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).</li><li>Andrew, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+motor-behavior+abnormalities+in+two+Drosophila+models+of+neurodevelopmental+disorders.">Spontaneous motor-behavior abnormalities in two Drosophila models of neurodevelopmental disorders.</a> Journal of Neurogenetics. 35 (1), 1-22 (2021).</li><li>Ueno, T., Tomita, J., Kume, S., Kume, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+Modulates+Metabolic+Rate+and+Temperature+Sensitivity+in+Drosophila+melanogaster.">Dopamine Modulates Metabolic Rate and Temperature Sensitivity in Drosophila melanogaster.</a> PLoS ONE. 7 (2), e31513 (2012).</li><li>Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+correlation+between+body+mass+and+metabolic+rate+in+Drosophila+melanogaster.">Lack of correlation between body mass and metabolic rate in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Insect Physiology. 50 (5), 445-453 (2004).</li><li>Norton, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeation+of+gases+through+solids.">Permeation of gases through solids.</a> Journal of Applied Physics. 28 (1), 34-39 (1957).</li><li>Hoegh-Guldberg, O., Manahan, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coulometric+measurement+of+oxygen-consumption+during+development+of+marine+invertebrate+embryos+and+larvae.">Coulometric measurement of oxygen-consumption during development of marine invertebrate embryos and larvae.</a> Journal of Experimental Biology. 198 (1), 19-30 (1995).</li><li>Sohal, R. S., Agarwal, A., Agarwal, S., Orr, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+overexpression+of+copper-+and+zinc-containing+superoxide+dismutase+and+catalase+retards+age-related+oxidative+damage+and+increases+metabolic+potential+in+Drosophila+melanogaster.">Simultaneous overexpression of copper- and zinc-containing superoxide dismutase and catalase retards age-related oxidative damage and increases metabolic potential in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (26), 15671-15674 (1995).</li><li>Van Voorhies, W. A., Melvin, R. G., Ballard, J. W. O., Williams, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+manometric+microrespirometers+for+measuring+oxygen+consumption+in+small+arthropods.">Validation of manometric microrespirometers for measuring oxygen consumption in small arthropods.</a> Journal of Insect Physiology. 54 (7), 1132-1137 (2008).</li><li>Herreid, C. F., Full, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cockroaches+on+a+treadmill:+Aerobic+running.">Cockroaches on a treadmill: Aerobic running.</a> Journal of Insect Physiology. 30 (5), 395-403 (1984).</li></ol>

Yukarıdaki prosedür, elektronik bir kulometrik mikrorespirometre kullanılarak D. Melanogaster'de O2 tüketiminin ölçümünü göstermektedir. Yabani tip D. melanogaster'de O2 tüketimi için elde edilen veriler, diğerleri tarafından bildirilenden biraz daha düşük olmasına rağmen, çeşitli yöntemler kullanılarak önceki yayınların çoğunda açıklanan aralıklar içindeydi (Tablo 1) 3,6.</p...

Metabolik hızı ölçme yeteneği, bir organizmanın çevresel bağlamında tam olarak anlaşılması için çok önemlidir. Örneğin, yaşam süresi1'deki rolünü, diyetin metabolizmadakirolünü 2 veya hipoksik stres eşiğini3 anlamak için metabolik hızı ölçmek gerekir.
Metabolizma hızını ölçmek için iki genel yaklaşım vardır4. Doğrudan kalorimetri, ısı üretimini ölçerek doğrudan enerji harcamasını ölçer. Dolaylı kalorimetri, enerji üretimini başka yollarla, genellikle O 2 tüketiminin (VO2), CO2 üretiminin veya her ikisinin respirometrik ölçümü yoluyla ölçer. Drosophila melanogaster5 dahil olmak üzere küçük ektotermlere doğrudan kalorimetri uygulanmış olsa da, respirometri teknik olarak daha basittir ve daha yaygın olarak kullanılır.
Yabani tip ve mutant D. melanogaster'de metabolik hızı ölçmek için çeşitli respirometri formları başarıyla kullanılmış ve sıcaklık6, sosyal çevre 3, diyet 3,7 ve nörogelişimsel bozuklukların8 metabolik etkileri hakkında fikir vermiştir. Bunlar, maliyet ve karmaşıklık açısından önemli ölçüde farklılık gösteren iki sınıfa ayrılır. Manometri, sineklerin bir CO2 emici içeren ve ince bir kılcal damar yoluyla bir sıvı rezervuarına bağlanan kapalı bir odaya yerleştirildiği en basit ve en ucuz 9,10'dur. O 2 tüketildikçe ve CO2 emildikçe, odadaki basınç azalır ve sıvı kılcal damara çekilir. Kılcal damarın sıvı dolu hacmi bu nedenle VO2 ile orantılıdır. Kılcal damardaki sıvının uyguladığı kuvveti telafi eden daha ayrıntılı versiyonlar da D. melanogaster 1'de kullanılmıştır. Manometri, basit ve ucuz olma avantajlarına sahiptir, ancak basınca duyarlı olduğu için sabit çevre koşulları gerektirir. Ayrıca, tüketilen O2 yerine konmadığı için, O2'nin (PO2) kısmi basıncı odaların içinde kademeli olarak azalır.
Gaz analizi kullanan respirometri de D. melanogaster için düzenli olarak kullanılmaktadır. Bu durumda, gazlar sinek içeren kapalı odalardan düzenli aralıklarla örneklenir ve bir kızılötesi analizöregönderilir 2,6,11. Bu tip aparatlar, ticari olarak temin edilebilmesi, çevresel koşullara daha az duyarlı olması ve numune alma sırasında gazların yenilenmesi ve böylece PO2'nin stabil kalması gibi avantajlara sahiptir. Bununla birlikte, ekipmanın çalıştırılması pahalı ve karmaşık olabilir.
Yakın zamanda geliştirilen bir kulometrik mikrorespirometre12, mevcut sistemlere ucuz, hassas ve istikrarlı bir alternatif sunar. Uygulamada, bir organizmaO2 tükettiği hava geçirmez bir odaya yerleştirilir ve solunan CO2 emici bir malzeme tarafından uzaklaştırılır, bu da oda basıncında net bir azalmaya neden olur. İç basınç önceden ayarlanmış bir eşiğe (AÇIK eşik) düştüğünde, akım bir elektrolitikO2 jeneratöründen geçirilir ve basıncı elektrolizi durduran ikinci bir eşiğe (OFF-eşik) döndürür. O2 jeneratörü boyunca yük transferi, odayı yeniden basınçlandırmak için gereken O2 miktarı ile doğru orantılıdır ve bu nedenle organizma4 tarafından tüketilenO2'yi ölçmek için kullanılabilir. Yöntem oldukça hassastır, V O2'yi hassas bir şekilde ölçer ve O2'nin düzenli olarak değiştirilmesi, PO2'yi saatler veya günler boyunca neredeyse sabit bir seviyede tutabilir.
Bu çalışmada kullanılan kulometrik mikrorespirometre, çok modlu (basınç, sıcaklık ve nem) bir elektronik sensör kullanır. Sensör, basınçtaki küçük değişiklikleri algılayan ve düşük basınç eşiğine12 ulaşıldığındaO2 üretimini etkinleştiren bir mikrodenetleyici tarafından çalıştırılır. Bu aparat raf parçalarından monte edilir, çok çeşitli odalar ve deney ortamları ile kullanılabilir ve vücut kütlesi ve sıcaklığının Tenebrio molitor böceği üzerindeki etkilerini incelemek için başarıyla kullanılmıştır. Bu çalışmada, mikrorespirometre, T. molitor kütlesinin yaklaşık% 1'ine sahip olan D. melanogaster'de O2 tüketimini ölçmek için uyarlanmıştır. O2 üretimini aktive etme eşiği düşürülerek aparatın hassasiyeti arttırılmıştır ve sıcaklık kontrollü bir su banyosunda deneyler yapılarak ve odaların içindeki nem% 100 veya buna yakın tutularak çevresel stabilite arttırılmıştır.
Membranla ilişkili guanilat kinazlar (MAGUK) ailesinin bir parçası olan CASK (Calmodulin'e bağımlı Serin Protein Kinaz) proteini, farklı çoklu protein komplekslerinde moleküler bir iskeledir ve CASK'deki mutasyonlar, insanlarda ve D. melanogaster'de nörogelişimsel bozukluklarla ilişkilidir 13,14. Canlı bir D. melanogaster mutantı, CASKΔ18, dopaminerjik nöronların 15 aktivitesini bozar ve konjenik kontrollere kıyasla aktivite seviyelerini %50'den fazla azaltır14,16. CASK mutantlarının azalmış aktivite seviyeleri ve katekolaminlerin metabolizmayı düzenlemedeki rolü17 nedeniyle, standart metabolik hızlarının ve dolayısıylaO2 tüketiminin kontrollere kıyasla önemli ölçüde azalacağını varsaydık.
O2 tüketimi CASKΔ18 ve bunların vahşi tip türdeşleri w(ex33) cinsinden ölçülmüştür. Sinek grupları respirometri odalarına yerleştirildi, O 2 tüketimi ölçüldü, O2 tüketimi hesaplandı ve hem kütleye özgü hem de sinek başına ifade edildi. Cihaz, önceki çalışmalarla tutarlı olan vahşi tip sineklerde V O2 kaydetti ve vahşi tip ve CASK mutant sineklerinin sinek başınaO2 tüketimini ayırt edebildi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>19/22 Thermometer Adapter</td>
			<td>Wilmad-Labglass</td>
			<td>ML-280-702</td>
			<td>Sensor Plug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Screwcap Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>3464</td>
			<td>O2 generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Pin Connector</td>
			<td>Zyamy</td>
			<td>40PIN-RFB10</td>
			<td>O2 generator: cut to 2-pin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Pin Female Connector</td>
			<td>TE Connectivity</td>
			<td>215299-4</td>
			<td>Sensor Plug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Polypropylene Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td>Cut to 5.5 cm and perforated&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint</td>
			<td>Laboy</td>
			<td>HMF050804</td>
			<td>Chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Conductor Cable</td>
			<td>Zenith</td>
			<td>6-Conductor 26 ga</td>
			<td>Cable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Pin Female Bulkhead Connector</td>
			<td>Switchcraft</td>
			<td>17982-6SG-300</td>
			<td>Controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Pin Female Connector</td>
			<td>Switchcraft</td>
			<td>18982-6SG-522</td>
			<td>Sensor plug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Pin Male Connector</td>
			<td>Switchcraft</td>
			<td>16982-6PG-522</td>
			<td>Cable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>800 ul centrifuge tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-120</td>
			<td>Soda Lime Cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABS Plastic Enclosure</td>
			<td>Bud Industries</td>
			<td>PS-11533-G</td>
			<td>Controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino Nano Every</td>
			<td>Arduino LLC</td>
			<td>ABX00028</td>
			<td>Controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BME 280 Sensor</td>
			<td>DIYMall</td>
			<td>FZ1639-BME280</td>
			<td>Sensor Plug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circuit Board</td>
			<td>Lheng</td>
			<td>5 X 7 cm</td>
			<td>Controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Sulfate</td>
			<td>BioPharm</td>
			<td>BC2045</td>
			<td>O2 Generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Azulle</td>
			<td>Byte4</td>
			<td>Data Acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Rolls</td>
			<td>Kajukajudo</td>
			<td>#2</td>
			<td>Cut in half to plug fly tubes 
			Cut in quarters for humidity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental Chamber</td>
			<td>Percival</td>
			<td>I30 VLC8</td>
			<td>Fly Care</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>JB Weld</td>
			<td>Plastic Bonder</td>
			<td>Secure Electrodes in O2 Generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Food</td>
			<td>Lab Express</td>
			<td>Type R</td>
			<td>Fly Care</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keck Clamps</td>
			<td>uxcell</td>
			<td>a20092300ux0418</td>
			<td>Secures glass joint of chamber to plug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-Viscosity Epoxy</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>E-30CL</td>
			<td>Sensor Plug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OLED Display</td>
			<td>IZOKEE</td>
			<td>IZKE31-IIC-WH-3</td>
			<td>Controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Wire 24 ga</td>
			<td>uGems</td>
			<td>14349</td>
			<td>O2 generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone grease</td>
			<td>Dow-Corning</td>
			<td>High Vacuum Grease</td>
			<td>Seals chamber-plug connection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soda Lime</td>
			<td>Jorvet</td>
			<td>JO553</td>
			<td>CO2 absorption</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toggle Switch</td>
			<td>E-Switch</td>
			<td>100SP1T1B1M1QEH</td>
			<td>Controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Cable</td>
			<td>Sabrent</td>
			<td>CB-UM63</td>
			<td>Controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Hub</td>
			<td>Atolla</td>
			<td>Hub 3.0</td>
			<td>Connect controllers to computer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>56-1165-33</td>
			<td>Temperature Control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath Tank</td>
			<td>Glass Cages</td>
			<td>15-liter rimless acrylic</td>
			<td>Bath for Respirometers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring o2 consumption in drosophila melanogaster using coulometric microrespirometry

Kulometrik mikrorespirometri, istikrarlı bir ortamı korurken küçük organizmalarınO2 tüketimini ölçmek için basit ve ucuz bir yöntemdir. Bir kulometrik mikrorespirometre,O2'nin tüketildiği ve organizma tarafından üretilen CO2'nin emici bir ortam tarafından uzaklaştırıldığı hava geçirmez bir odadan oluşur. Ortaya çıkan basınç düşüşü elektrolitik O2 üretimini tetikler ve üretilenO2 miktarı, onu üretmek için kullanılan yük miktarı kaydedilerek ölçülür. Bu çalışmada yöntem, aparatın hassasiyeti ve yüksek stabilite için optimize edilmiş çevresel koşullar ile küçük gruplar halinde test edilen Drosophila melanogaster'e uyarlanmıştır. Bu aparattaki yabani tip sinekler tarafından tüketilen O2 miktarı, önceki çalışmalarla ölçülenle tutarlıdır. Daha küçük ve daha az aktif olduğu bilinen CASK mutantları tarafından kütleye özgüO2 tüketimi, konjenik kontrollerden farklı değildi. Bununla birlikte, CASK mutantlarının küçük boyutu, uçuş başınaO2 tüketiminde önemli bir azalmaya neden oldu. Bu nedenle, mikrorespirometre D. melanogaster'de O2 tüketimini ölçebilir, genotipler arasındaki mütevazı farklılıkları ayırt edebilir ve metabolik hızları ölçmek için çok yönlü bir araç ekler.

The ability to measure metabolic rate is crucial for a complete understanding of an organism in its environmental context. For example, it is necessary to measure metabolic rate in order to understand its role in lifespan1, the role of diet in metabolism2, or the threshold for hypoxic stress3.
There are two general approaches to measuring the metabolic rate4. Direct calorimetry measures energy expenditure directly by measuring heat production. Indirect calorimetry measures energy production through other means, often via respirometric measurement of O2 consumption (VO2), CO2 production or both. Although direct calorimetry has been applied to small ectotherms, including Drosophila melanogaster5, respirometry is technically simpler and more commonly used.
Several forms of respirometry have been used successfully to measure metabolic rate in wildtype and mutant D. melanogaster and have provided insight into the metabolic effects of temperature6, social environment3, diet3,7,and neurodevelopmental disorders8. These fall into two classes, which vary considerably in cost and complexity. Manometry is the simplest and least expensive9,10, in which flies are placed into a sealed chamber that contains a CO2 absorbent and which is connected via a thin capillary to a fluid reservoir. As O2 is consumed and CO2 absorbed, pressure in the chamber decreases and fluid is drawn into the capillary. The fluid-filled volume of the capillary is therefore proportional to VO2. More elaborate versions, which compensate for the force exerted by the fluid in the capillary, have also been used on D. melanogaster1. Manometry has the advantages of being simple and inexpensive, but, because it is sensitive to pressure, requires constant environmental conditions. Further, because consumed O2 is not replaced, the partial pressure of O2 (PO2) gradually decreases inside the chambers.
Respirometry using gas analysis is also regularly used for D. melanogaster. In this case, gases are sampled at regular intervals from sealed chambers containing flies and sent to an infrared analyzer2,6,11. This type of apparatus has the advantages that it is available commercially, is less sensitive to environmental conditions, and gases are refreshed during sampling so that PO2 remains stable. However, the equipment can be expensive and complex to operate.
A recently developed coulometric microrespirometer12 provides an inexpensive, sensitive, and stable alternative to existing systems. In practice, an organism is placed into an airtight chamber where it consumes O2 and the exhaled CO2 is removed by an absorbent material, resulting in a net decrease in chamber pressure. When the internal pressure decreases to a pre-set threshold (ON-threshold), current is passed through an electrolytic O2 generator, returning pressure to a second threshold (OFF-threshold) stopping electrolysis. Charge transfer across the O2 generator is directly proportional to the amount of O2 required to re-pressurize the chamber and can therefore be used to measure the O2 consumed by the organism4. The method is highly sensitive, measures VO2 precisely, and the regular replacement of O2 can maintain PO2 at a nearly constant level for hours or days.
The coulometric microrespirometer used in this study employs a multi-modal (pressure, temperature, and humidity) electronic sensor. The sensor is operated by a microcontroller that detects small changes in pressure and activates O2 generation when a low pressure threshold is reached12. This apparatus is assembled from off the shelf parts, can be used with a wide variety of chambers and experimental environments, and has been employed successfully to examine the effects of body mass and temperature on the beetle Tenebrio molitor. In the present study, the microrespirometer has been adapted to measure O2 consumption in D. melanogaster, which has approximately 1% of the mass of T. molitor. Sensitivity of the apparatus has been increased by reducing the threshold for activating O2 generation, and environmental stability has been enhanced by conducting experiments in a temperature-controlled water bath and by maintaining humidity inside the chambers at or near 100%.
The CASK (Calmodulin-dependent Serine Protein Kinase) protein, part of the family of membrane-associated guanylate kinases (MAGUK), is a molecular scaffold in different multi-protein complexes, and mutations in CASK are associated with neurodevelopmental disorders in humans and in D. melanogaster13,14. A viable D. melanogaster mutant, CASK&#916;18, disrupts activity of dopaminergic neurons15 and reduces activity levels by more than 50% compared to congenic controls14,16. Because of the reduced activity levels of CASK mutants and the role of catecholamines in regulating metabolism17 we hypothesized that their standard metabolic rate, and therefore O2 consumption, would be dramatically reduced compared to controls.
O2 consumption was measured in CASK&#916;18 and their wildtype congeners, w(ex33). Groups of flies were placed into respirometry chambers, O2 consumption was measured, O2 consumption was calculated and expressed on both a mass-specific and per-fly basis. The apparatus recorded VO2 in wildtype flies that was consistent with previous studies, and it could differentiate between the per-fly O2 consumption of wildtype and CASK mutant flies.

Author Spotlight: Influence of Temperature on Drosophila melanogaster and Desert-Adapted Beetles 

Kulometrik Mikrorespirometri Kullanılarak Drosophila melanogaster'de O2 Tüketiminin Ölçülmesi

Respirometre kontrolörünün basınç ve akım çıkışları, Şekil 3A'da bir deneyde bir oda için gösterilmiştir. İlk, uzun akım darbesi, odayı ortam basıncından (yaklaşık 992 hPa) önceden ayarlanmış 1017 hPa'lık KAPALI eşiğine kadar basınçlandırdı. Sinekler O 2 ve CO 2 tükettikçe, basınç 1016 hPa'lık AÇIK eşiğine ulaşana kadar yavaşça azaldı ve bu da O2 jeneratörü aracılığıyla akımı etkinleştirdi. Gösterilen örn...

Watch this Scientific Journal Video about Influence of Temperature on Drosophila melanogaster and Desert-Adapted Beetles at JoVE.com

Kulometrik respirometri, küçük organizmaların metabolik hızını ölçmek için idealdir. Bu çalışmada Drosophila melanogaster için uyarlandığında, ölçülenO2 tüketimi, önceki çalışmalarda vahşi tip D. melanogaster için bildirilen aralık içindeydi. Daha küçük ve daha az aktif olan CASK mutantları tarafından sinek başınaO2 tüketimi, vahşi tipten önemli ölçüde daha düşüktü.

Coulometric microrespirometry is a straightforward, inexpensive method for measuring the O2 consumption of small organisms while maintaining a stable ...

Araştırmamız, sıcaklık ve aktivitenin böcek metabolizmasını nasıl etkilediğine odaklanmıştır. Bu, türlerin çevrelerinde hayatta kalmak için nasıl evrimleştiklerini ve değişen bir dünyaya nasıl uyum sağlamaya devam edeceklerini anlamak için çok önemlidir. Bireysel organizmaların fizyolojisini ve davranışını anlamak bu çaba için çok önemlidir.Metabolizma hızı, ısı üretimi ölçülerek doğrudan veya oksijen tüketimi veya karbondioksit üretimi ölçülerek dolaylı olarak ölçülebilir. Meyve sineği kadar küçük bir organizmanın ısı üretimini ölçmek teknik olarak mümkün olsa da, dolaylı yöntemler daha yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu ölçekte metabolizmayı ölçmenin mevcut zorlukları arasında maliyet, çevresel istikrar ve güvenilirlik yer alacaktır.Ticari olarak temin edilebilen sistemler güvenilir, istikrarlı ve satın alınması nispeten kolaydır, ancak karmaşık ve pahalı olabilirler. DIY manometreler ucuzdur, ancak hataya neden olabilir ve her deney için üretim gerektirebilir. Kulometrik respirometre nispeten ucuzdur, kullanımı kolaydır, çevresel parametrelerin uygun bir şekilde okunmasını sağlar ve tüm bileşenler yeniden kullanılabilir.Ek olarak, oksijenin düzenli olarak değiştirilmesi, saatlerce hatta günlerce stabil bir ortam sağlar. Laboratuvarda, drosophila'nın yerleşik kontrol suşları arasındaki metabolik varyasyonu ve hiper ve hipoaktif mutantların oksijen tüketimi üzerindeki etkilerini inceleyeceğiz. Sahada, vahşi, çöle adapte olmuş böceklerin metabolik hızlarını ve sıcaklık toleransını incelemeye başlayacağız.