אנו מודים לד"ר לינדה רסטיפו מאוניברסיטת אריזונה על שהציעה לבדוק את צריכת O2 של מוטציות CASK ועל שליחת מוטנטי CASK והבקרות הקונגניות שלהם. דמי הפרסום ניתנו על ידי הקרן המחלקתית להשקעה מחדש מהמחלקה לביולוגיה באוניברסיטת קולג' פארק. שטח וכמה ציוד סופקו על ידי האוניברסיטאות בשיידי גרוב.

1. גידול ואיסוף זבובים
<ol><li>יש לשמור על זבובים בטמפרטורה של 25°C בבקבוקונים צרים המכילים מזון דרוזופילה סטנדרטי. הערה: גודל הדגימה עבור כל גנוטיפ צריך לכלול לפחות תשעה עותקים משוכפלים, שכל אחד מהם מורכב מתא רספירומטר יחיד המכיל 15-25 זבובים, המוגדרים כמתואר להלן.</li>
	<li>מעבירים ?...

התאמת מיקרו-רספירומטריה לדרוזופילה - תובנות על מטבוליזם מוטנטי של CASK

<ol>
	<li>Arking, R., Buck, S., Wells, R. A., Pretzlaff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+rates+in+genetically+based+long+lived+strains+of+Drosophila.">Metabolic rates in genetically based long lived strains of Drosophila.</a> Experimental Gerontology. 23 (1), 59-76 (1988).</li><li>Henry, Y., Overgaard, J., Colinet, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+nutrient+balance+shapes+phenotypic+traits+of+Drosophila+melanogaster+in+interaction+with+gut+microbiota.">Dietary nutrient balance shapes phenotypic traits of Drosophila melanogaster in interaction with gut microbiota.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular &amp; Integrative Physiology. 241, 110626 (2020).</li><li>Burggren, W., Souder, B. M., Ho, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+rate+and+hypoxia+tolerance+are+affected+by+group+interactions+and+sex+in+the+fruit+fly+(Drosophila+melanogaster):+new+data+and+a+literature+survey.">Metabolic rate and hypoxia tolerance are affected by group interactions and sex in the fruit fly (Drosophila melanogaster): new data and a literature survey.</a> Biology Open. 6, 471-480 (2017).</li><li>Lighton, J. R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Measuring Metabolic Rates. , (2019).</li><li>Fiorino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallelized,+real-time,+metabolic-rate+measurements+from+individual+Drosophila.">Parallelized, real-time, metabolic-rate measurements from individual Drosophila.</a> Scientific Reports. 8 (1), 14452 (2018).</li><li>Berrigan, D., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+temperature+and+activity+on+the+rate+of+adult+Drosophila+melanogaster.">Influence of temperature and activity on the rate of adult Drosophila melanogaster.</a> Comparative Biochemistry and Physiology. 118 (4), 1301-1307 (1997).</li><li>Hulbert, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+rate+is+not+reduced+by+dietary-restriction+or+by+lowered+insulin/IGF-1+signalling+and+is+not+correlated+with+individual+lifespan+in+Drosophila+melanogaster.">Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster.</a> Experimental Gerontology. 39 (8), 1137-1143 (2004).</li><li>Botero, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofibromin+regulates+metabolic+rate+via+neuronal+mechanisms+in+Drosophila.">Neurofibromin regulates metabolic rate via neuronal mechanisms in Drosophila.</a> Nature Communications. 12 (1), 4285 (2021).</li><li>Yatsenko, A. S., Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Shcherbata, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Metabolic+Rate+in+Drosophila+using+Respirometry.">Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 51681 (2014).</li><li>Ross, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-specific+decrease+in+aerobic+efficiency+associated+with+increase+in+oxygen+free+radical+production+in+Drosophila+melanogaster.">Age-specific decrease in aerobic efficiency associated with increase in oxygen free radical production in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Insect Physiology. 46 (11), 1477-1480 (2000).</li><li>Brown, E. B., Klok, J., Keene, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+metabolic+rate+in+single+flies+during+sleep+and+waking+states+via+indirect+calorimetry.">Measuring metabolic rate in single flies during sleep and waking states via indirect calorimetry.</a> Journal of Neuroscience Methods. 376, 109606 (2022).</li><li>Sandstrom, D. J., Offord, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+oxygen+consumption+in+Tenebrio+molitor+using+a+sensitive,+inexpensive,+sensor-based+coulometric+microrespirometer.">Measurement of oxygen consumption in Tenebrio molitor using a sensitive, inexpensive, sensor-based coulometric microrespirometer.</a> Journal of Experimental Biology. 225 (9), jeb243966 (2022).</li><li>Becker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+dysfunction+in+CASK-related+neurodevelopmental+disorders.">Presynaptic dysfunction in CASK-related neurodevelopmental disorders.</a> Translational Psychiatry. 10 (1), 312 (2020).</li><li>Slawson, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Regulation+of+Locomotor+Behavior+of+Drosophila+melanogaster+Depends+on+a+CASK+Isoform+Containing+CaMK-Like+and+L27+Domains.">Central Regulation of Locomotor Behavior of Drosophila melanogaster Depends on a CASK Isoform Containing CaMK-Like and L27 Domains.</a> Genetics. 187 (1), 171-184 (2011).</li><li>Slawson, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+dopamine+release+by+CASK-&#206;2+modulates+locomotor+initiation+in+Drosophila+melanogaster.">Regulation of dopamine release by CASK-&#206;2 modulates locomotor initiation in Drosophila melanogaster.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).</li><li>Andrew, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+motor-behavior+abnormalities+in+two+Drosophila+models+of+neurodevelopmental+disorders.">Spontaneous motor-behavior abnormalities in two Drosophila models of neurodevelopmental disorders.</a> Journal of Neurogenetics. 35 (1), 1-22 (2021).</li><li>Ueno, T., Tomita, J., Kume, S., Kume, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+Modulates+Metabolic+Rate+and+Temperature+Sensitivity+in+Drosophila+melanogaster.">Dopamine Modulates Metabolic Rate and Temperature Sensitivity in Drosophila melanogaster.</a> PLoS ONE. 7 (2), e31513 (2012).</li><li>Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+correlation+between+body+mass+and+metabolic+rate+in+Drosophila+melanogaster.">Lack of correlation between body mass and metabolic rate in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Insect Physiology. 50 (5), 445-453 (2004).</li><li>Norton, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeation+of+gases+through+solids.">Permeation of gases through solids.</a> Journal of Applied Physics. 28 (1), 34-39 (1957).</li><li>Hoegh-Guldberg, O., Manahan, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coulometric+measurement+of+oxygen-consumption+during+development+of+marine+invertebrate+embryos+and+larvae.">Coulometric measurement of oxygen-consumption during development of marine invertebrate embryos and larvae.</a> Journal of Experimental Biology. 198 (1), 19-30 (1995).</li><li>Sohal, R. S., Agarwal, A., Agarwal, S., Orr, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+overexpression+of+copper-+and+zinc-containing+superoxide+dismutase+and+catalase+retards+age-related+oxidative+damage+and+increases+metabolic+potential+in+Drosophila+melanogaster.">Simultaneous overexpression of copper- and zinc-containing superoxide dismutase and catalase retards age-related oxidative damage and increases metabolic potential in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (26), 15671-15674 (1995).</li><li>Van Voorhies, W. A., Melvin, R. G., Ballard, J. W. O., Williams, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+manometric+microrespirometers+for+measuring+oxygen+consumption+in+small+arthropods.">Validation of manometric microrespirometers for measuring oxygen consumption in small arthropods.</a> Journal of Insect Physiology. 54 (7), 1132-1137 (2008).</li><li>Herreid, C. F., Full, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cockroaches+on+a+treadmill:+Aerobic+running.">Cockroaches on a treadmill: Aerobic running.</a> Journal of Insect Physiology. 30 (5), 395-403 (1984).</li></ol>

ההליך לעיל מדגים מדידה של צריכת O2 ב- D. Melanogaster באמצעות מיקרו-רספירומטר קולומטרי אלקטרוני. הנתונים שהתקבלו עבור צריכת O2 במלנוגסטר מסוג D פראי היו בטווח שתואר ברוב הפרסומים הקודמים בשיטות מגוונות (טבלה 1), אם כי נמוכים במקצת מאלה שדווחו על ידי אחרים 3,6<sup class=...

היכולת למדוד קצב חילוף חומרים חיונית להבנה מלאה של אורגניזם בהקשר הסביבתי שלו. לדוגמה, יש צורך למדוד את קצב חילוף החומרים כדי להבין את תפקידו בתוחלת החיים1, את תפקיד הדיאטה בחילוף החומרים2, או את הסף ללחץ היפוקסי3.
ישנן שתי גישות כלליות למדידת קצב חילוף החומרים4. קלורימטריה ישירה מודדת את הוצאת האנרגיה ישירות על ידי מדידת ייצור חום. קלורימטריה עקיפה מודדת את ייצור האנרגיה באמצעים אחרים, לעתים קרובות באמצעות מדידה ספירומטרית של צריכת O 2 (VO2), ייצור CO2 או שניהם. למרות שקלורימטריה ישירה יושמה על אקטורמות קטנות, כולל Drosophila melanogaster5, רספירומטריה היא פשוטה יותר מבחינה טכנית ונפוצה יותר.
מספר צורות של רספירומטריה שימשו בהצלחה למדידת קצב חילוף החומרים בטבע ובמוטציה D. melanogaster וסיפקו תובנה לגבי ההשפעות המטבוליות של טמפרטורה6, סביבה חברתית 3, תזונה 3,7 והפרעות נוירו-התפתחותיות8. אלה נופלים לשני סוגים, אשר משתנים במידה ניכרת בעלות ובמורכבות. מנומטריה היאה-9,10 הפשוטה והזולה ביותר, שבה הזבובים מוכנסים לתא אטום המכיל סופגCO2 ומחובר באמצעות נימים דקים למאגר נוזלים. כאשר O 2 נצרך ו- CO2 נספג, הלחץ בחדר יורד ונוזל נשאב לתוך הנימים. הנפח המלא בנוזל של הנימים הוא אפוא פרופורציונלי ל- VO2. גרסאות משוכללות יותר, המפצות על הכוח המופעל על ידי הנוזל בנימים, שימשו גם על D. melanogaster1. למנומטריה יש את היתרונות של היותה פשוטה וזולה, אך מכיוון שהיא רגישה ללחץ, דורשת תנאי סביבה קבועים. יתר על כן, מכיוון שנצרך O 2 אינו מוחלף, הלחץ החלקי של O2 (PO2) יורד בהדרגה בתוך החדרים.
רספירומטריה באמצעות ניתוח גז משמשת באופן קבוע גם עבור D. melanogaster. במקרה זה, גזים נדגמים במרווחי זמן קבועים מחדרים אטומים המכילים זבובים ונשלחים לאנלייזר אינפרא אדום 2,6,11. לסוג זה של מכשיר יש את היתרונות שהוא זמין מסחרית, הוא פחות רגיש לתנאי הסביבה, וגזים מתחדשים במהלך הדגימה כך ש- PO2 נשאר יציב. עם זאת, הציוד יכול להיות יקר ומורכב לתפעול.
מיקרו-רספירומטרקולומטרי 12 שפותח לאחרונה מספק חלופה זולה, רגישה ויציבה למערכות קיימות. בפועל, אורגניזם ממוקם לתוך תא אטום שבו הוא צורך O 2 ואת CO2 נשוף מוסר על ידי חומר סופג, וכתוצאה מכך ירידה נטו בלחץ החדר. כאשר הלחץ הפנימי יורד לסף מוגדר מראש (ON-threshold), הזרם מועבר דרך מחולל אלקטרוליטי O2, ומחזיר את הלחץ לסף שני (OFF-threshold) העוצר אלקטרוליזה. העברת מטען על פני מחולל O 2 עומדת ביחס ישר לכמות O 2 הנדרשת ללחץ מחדש על התא ולכן ניתן להשתמש בה כדי למדוד את O2 הנצרך על ידי האורגניזם4. השיטה רגישה מאוד, מודדת V O2 במדויק, וההחלפה הקבועה של O2 יכולה לשמור על PO2 ברמה כמעט קבועה במשך שעות או ימים.
המיקרו-רספירומטר הקולומטרי המשמש במחקר זה משתמש בחיישן אלקטרוני רב-מודאלי (לחץ, טמפרטורה ולחות). החיישן מופעל על ידי מיקרו-בקר המזהה שינויים קטנים בלחץ ומפעיל דורO 2 כאשר מגיעים לסף לחץ נמוך12. מכשיר זה מורכב מחלקי המדף, ניתן להשתמש בו עם מגוון רחב של תאים וסביבות ניסוי, ושימש בהצלחה לבחינת ההשפעות של מסת הגוף והטמפרטורה על החיפושית Tenebrio molitor. במחקר הנוכחי, המיקרו-רספירומטר הותאם למדידת צריכת O2 ב- D. melanogaster, שיש לו כ -1% מהמסה של T. molitor. רגישות המנגנון הוגברה על ידי הפחתת הסף להפעלת דורO 2 , והיציבות הסביבתית שופרה על ידי ביצוע ניסויים באמבט מים מבוקר טמפרטורה ועל ידי שמירה על לחות בתוך התאים ברמה של 100% או קרוב לכך.
חלבון CASK (Calmodulin-dependent Serine Protein Kinase), חלק ממשפחת הקינאזות הגואנילטות הקשורות לקרום (MAGUK), הוא פיגום מולקולרי בקומפלקסים רב-חלבוניים שונים, ומוטציות ב-CASK קשורות להפרעות נוירו-התפתחותיות בבני אדם וב-D. melanogaster13,14. מוטציה בת קיימא של D. melanogaster, CASKΔ18, משבשת את הפעילות של נוירונים דופמינרגיים 15 ומפחיתה את רמות הפעילות ביותר מ-50% בהשוואה לבקרות קונגניות14,16. בגלל רמות הפעילות הנמוכות יותר של מוטציות CASK ותפקידם של קטכולאמינים בוויסות חילוף החומרים17 שיערנו שקצב חילוף החומרים הסטנדרטי שלהם, ולכן צריכת O2, יופחתו באופן דרמטי בהשוואה לבקרות.
צריכת O2 נמדדה ב-CASKΔ18 ובקונגנרים הפראיים שלהם, w(ex33). קבוצות של זבובים הוכנסו לתאי רספירומטריה, צריכת O 2 נמדדה, צריכת O2 חושבה והתבטאה הן על בסיס מסה ספציפית והן על בסיס זבוב. המנגנון תיעד VO2 בזבובי בר שהיה עקבי עם מחקרים קודמים, והוא יכול היה להבדיל בין צריכת O2 לכל זבוב של זבובי בר לבין צריכת מוטציות CASK לכל זבוב.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>19/22 Thermometer Adapter</td>
			<td>Wilmad-Labglass</td>
			<td>ML-280-702</td>
			<td>Sensor Plug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Screwcap Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>3464</td>
			<td>O2 generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Pin Connector</td>
			<td>Zyamy</td>
			<td>40PIN-RFB10</td>
			<td>O2 generator: cut to 2-pin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Pin Female Connector</td>
			<td>TE Connectivity</td>
			<td>215299-4</td>
			<td>Sensor Plug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Polypropylene Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td>Cut to 5.5 cm and perforated&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint</td>
			<td>Laboy</td>
			<td>HMF050804</td>
			<td>Chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Conductor Cable</td>
			<td>Zenith</td>
			<td>6-Conductor 26 ga</td>
			<td>Cable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Pin Female Bulkhead Connector</td>
			<td>Switchcraft</td>
			<td>17982-6SG-300</td>
			<td>Controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Pin Female Connector</td>
			<td>Switchcraft</td>
			<td>18982-6SG-522</td>
			<td>Sensor plug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Pin Male Connector</td>
			<td>Switchcraft</td>
			<td>16982-6PG-522</td>
			<td>Cable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>800 ul centrifuge tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-120</td>
			<td>Soda Lime Cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABS Plastic Enclosure</td>
			<td>Bud Industries</td>
			<td>PS-11533-G</td>
			<td>Controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino Nano Every</td>
			<td>Arduino LLC</td>
			<td>ABX00028</td>
			<td>Controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BME 280 Sensor</td>
			<td>DIYMall</td>
			<td>FZ1639-BME280</td>
			<td>Sensor Plug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circuit Board</td>
			<td>Lheng</td>
			<td>5 X 7 cm</td>
			<td>Controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Sulfate</td>
			<td>BioPharm</td>
			<td>BC2045</td>
			<td>O2 Generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Azulle</td>
			<td>Byte4</td>
			<td>Data Acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Rolls</td>
			<td>Kajukajudo</td>
			<td>#2</td>
			<td>Cut in half to plug fly tubes 
			Cut in quarters for humidity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental Chamber</td>
			<td>Percival</td>
			<td>I30 VLC8</td>
			<td>Fly Care</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>JB Weld</td>
			<td>Plastic Bonder</td>
			<td>Secure Electrodes in O2 Generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Food</td>
			<td>Lab Express</td>
			<td>Type R</td>
			<td>Fly Care</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keck Clamps</td>
			<td>uxcell</td>
			<td>a20092300ux0418</td>
			<td>Secures glass joint of chamber to plug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-Viscosity Epoxy</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>E-30CL</td>
			<td>Sensor Plug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OLED Display</td>
			<td>IZOKEE</td>
			<td>IZKE31-IIC-WH-3</td>
			<td>Controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Wire 24 ga</td>
			<td>uGems</td>
			<td>14349</td>
			<td>O2 generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone grease</td>
			<td>Dow-Corning</td>
			<td>High Vacuum Grease</td>
			<td>Seals chamber-plug connection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soda Lime</td>
			<td>Jorvet</td>
			<td>JO553</td>
			<td>CO2 absorption</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toggle Switch</td>
			<td>E-Switch</td>
			<td>100SP1T1B1M1QEH</td>
			<td>Controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Cable</td>
			<td>Sabrent</td>
			<td>CB-UM63</td>
			<td>Controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Hub</td>
			<td>Atolla</td>
			<td>Hub 3.0</td>
			<td>Connect controllers to computer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>56-1165-33</td>
			<td>Temperature Control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath Tank</td>
			<td>Glass Cages</td>
			<td>15-liter rimless acrylic</td>
			<td>Bath for Respirometers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring o2 consumption in drosophila melanogaster using coulometric microrespirometry

מיקרו-רספירומטריה קולומטרית היא שיטה פשוטה וזולה למדידת צריכת O2 של אורגניזמים קטנים תוך שמירה על סביבה יציבה. מיקרו-רספירומטר קולומטרי מורכב מתא אטום שבו O 2 נצרך וה- CO2 המיוצר על ידי האורגניזם מוסר על ידי מדיום סופג. ירידת הלחץ כתוצאה מכך מפעילה ייצור אלקטרוליטי O 2, וכמות O2 המיוצרת נמדדת על ידי רישום כמות המטען המשמש ליצירתו. במחקר הנוכחי הותאמה השיטה לדרוזופילה מלנוגסטר שנבדקה בקבוצות קטנות, כאשר רגישות המכשיר ותנאי הסביבה מותאמים ליציבות גבוהה. כמות O2 הנצרכת על ידי זבובי בר במנגנון זה עקבית עם זו שנמדדה על ידי מחקרים קודמים. צריכת O2 ספציפית למסה על ידי מוטנטים של TASK, שהם קטנים יותר וידועים כפחות פעילים, לא הייתה שונה מקבוצת ביקורת קונגנית. עם זאת, הגודל הקטן של מוטנטים CASK הביא לירידה משמעותית בצריכת O2 על בסיס זבוב. לכן, המיקרו-רספירומטר מסוגל למדוד את צריכת O2 ב-D. melanogaster, יכול להבחין בהבדלים צנועים בין גנוטיפים, ומוסיף כלי רב-תכליתי למדידת קצב חילוף החומרים.

The ability to measure metabolic rate is crucial for a complete understanding of an organism in its environmental context. For example, it is necessary to measure metabolic rate in order to understand its role in lifespan1, the role of diet in metabolism2, or the threshold for hypoxic stress3.
There are two general approaches to measuring the metabolic rate4. Direct calorimetry measures energy expenditure directly by measuring heat production. Indirect calorimetry measures energy production through other means, often via respirometric measurement of O2 consumption (VO2), CO2 production or both. Although direct calorimetry has been applied to small ectotherms, including Drosophila melanogaster5, respirometry is technically simpler and more commonly used.
Several forms of respirometry have been used successfully to measure metabolic rate in wildtype and mutant D. melanogaster and have provided insight into the metabolic effects of temperature6, social environment3, diet3,7,and neurodevelopmental disorders8. These fall into two classes, which vary considerably in cost and complexity. Manometry is the simplest and least expensive9,10, in which flies are placed into a sealed chamber that contains a CO2 absorbent and which is connected via a thin capillary to a fluid reservoir. As O2 is consumed and CO2 absorbed, pressure in the chamber decreases and fluid is drawn into the capillary. The fluid-filled volume of the capillary is therefore proportional to VO2. More elaborate versions, which compensate for the force exerted by the fluid in the capillary, have also been used on D. melanogaster1. Manometry has the advantages of being simple and inexpensive, but, because it is sensitive to pressure, requires constant environmental conditions. Further, because consumed O2 is not replaced, the partial pressure of O2 (PO2) gradually decreases inside the chambers.
Respirometry using gas analysis is also regularly used for D. melanogaster. In this case, gases are sampled at regular intervals from sealed chambers containing flies and sent to an infrared analyzer2,6,11. This type of apparatus has the advantages that it is available commercially, is less sensitive to environmental conditions, and gases are refreshed during sampling so that PO2 remains stable. However, the equipment can be expensive and complex to operate.
A recently developed coulometric microrespirometer12 provides an inexpensive, sensitive, and stable alternative to existing systems. In practice, an organism is placed into an airtight chamber where it consumes O2 and the exhaled CO2 is removed by an absorbent material, resulting in a net decrease in chamber pressure. When the internal pressure decreases to a pre-set threshold (ON-threshold), current is passed through an electrolytic O2 generator, returning pressure to a second threshold (OFF-threshold) stopping electrolysis. Charge transfer across the O2 generator is directly proportional to the amount of O2 required to re-pressurize the chamber and can therefore be used to measure the O2 consumed by the organism4. The method is highly sensitive, measures VO2 precisely, and the regular replacement of O2 can maintain PO2 at a nearly constant level for hours or days.
The coulometric microrespirometer used in this study employs a multi-modal (pressure, temperature, and humidity) electronic sensor. The sensor is operated by a microcontroller that detects small changes in pressure and activates O2 generation when a low pressure threshold is reached12. This apparatus is assembled from off the shelf parts, can be used with a wide variety of chambers and experimental environments, and has been employed successfully to examine the effects of body mass and temperature on the beetle Tenebrio molitor. In the present study, the microrespirometer has been adapted to measure O2 consumption in D. melanogaster, which has approximately 1% of the mass of T. molitor. Sensitivity of the apparatus has been increased by reducing the threshold for activating O2 generation, and environmental stability has been enhanced by conducting experiments in a temperature-controlled water bath and by maintaining humidity inside the chambers at or near 100%.
The CASK (Calmodulin-dependent Serine Protein Kinase) protein, part of the family of membrane-associated guanylate kinases (MAGUK), is a molecular scaffold in different multi-protein complexes, and mutations in CASK are associated with neurodevelopmental disorders in humans and in D. melanogaster13,14. A viable D. melanogaster mutant, CASK&#916;18, disrupts activity of dopaminergic neurons15 and reduces activity levels by more than 50% compared to congenic controls14,16. Because of the reduced activity levels of CASK mutants and the role of catecholamines in regulating metabolism17 we hypothesized that their standard metabolic rate, and therefore O2 consumption, would be dramatically reduced compared to controls.
O2 consumption was measured in CASK&#916;18 and their wildtype congeners, w(ex33). Groups of flies were placed into respirometry chambers, O2 consumption was measured, O2 consumption was calculated and expressed on both a mass-specific and per-fly basis. The apparatus recorded VO2 in wildtype flies that was consistent with previous studies, and it could differentiate between the per-fly O2 consumption of wildtype and CASK mutant flies.

מחבר זרקור: השפעת הטמפרטורה על Drosophila melanogaster וחיפושיות מותאמות מדבר 

מדידת צריכת O2 בדרוזופילה מלנוגסטר באמצעות מיקרו-רספירומטריה קולומטרית

Our research is focused on how temperature and activity affect insect metabolism. This is essential to understand how species have evolved to survive in their surroundings, and how they will continue to adapt in a changing world. Understanding the physiology and behavior of individual organisms is crucial to this endeavor.Metabolic rate can be measured directly by measuring heat production, or indirectly by measuring the consumption of oxygen or the production of carbon dioxide. Although it is technically possible to measure heat production by an organism as small as a fruit fly, indirect methods are used more commonly. The current challenges to measuring metabolism on this scale will include cost, environmental stability, and reliability.Commercially available systems are reliable, stable, and relatively easy to purchase, but they can be complex and expensive. DIY manometers are inexpensive, but can introduce error and require fabrication for each experiment. The coulometric respirometer is relatively inexpensive, easy to use, provides a convenient readout of environmental parameters, and all components are reusable.In addition, the regular replacement of oxygen maintains a stable environment for hours or even days. In the lab, we'll be studying the metabolic variation between established control strains of drosophila, and the effects of hyper and hypoactive mutants on oxygen consumption. In the field, we'll begin studying the metabolic rates and temperature tolerance of wild, desert-adapted beetles.

הלחץ ותפוקות הזרם של בקר הרספירומטר מוצגים עבור תא אחד בניסוי אחד באיור 3A. פעימת הזרם הארוך הראשונה לחצה על התא מלחץ הסביבה (כ-992 hPa) לסף OFF שנקבע מראש של 1017 hPa. כאשר הזבובים שצרכו O 2 ו-CO 2 נספגו, הלחץ ירד לאט עד שהגיע לסף ON של 1016 hPa, אשר הפעיל זרם דרך מחולל O2. בדוגמ...

Watch this Scientific Journal Video about Influence of Temperature on Drosophila melanogaster and Desert-Adapted Beetles at JoVE.com

ספירומטריה קולומטרית אידיאלית למדידת קצב חילוף החומרים של אורגניזמים קטנים. כאשר הותאם עבור Drosophila melanogaster במחקר הנוכחי, צריכת O2 שנמדדה הייתה בטווח שדווח עבור סוג בר D. melanogaster על ידי מחקרים קודמים. צריכת O2 לכל זבוב על ידי מוטנטים של ASK שהם קטנים יותר ופעילים פחות, הייתה נמוכה משמעותית מזו של ה-wildtype .

Coulometric microrespirometry is a straightforward, inexpensive method for measuring the O2 consumption of small organisms while maintaining a stable ...

המחקר שלנו מתמקד באופן שבו טמפרטורה ופעילות משפיעות על חילוף החומרים של חרקים. זה חיוני כדי להבין כיצד מינים התפתחו כדי לשרוד בסביבתם, וכיצד הם ימשיכו להסתגל בעולם משתנה. הבנת הפיזיולוגיה וההתנהגות של אורגניזמים בודדים היא חיונית למאמץ זה.קצב חילוף החומרים יכול להימדד ישירות על ידי מדידת ייצור חום, או בעקיפין על ידי מדידת צריכת חמצן או ייצור פחמן דו חמצני. למרות שניתן מבחינה טכנית למדוד את ייצור החום על ידי אורגניזם קטן כמו זבוב פירות, שיטות עקיפות משמשות בדרך כלל. האתגרים הנוכחיים למדידת חילוף החומרים בקנה מידה זה יכללו עלות, יציבות סביבתית ואמינות.מערכות מסחריות הן אמינות, יציבות וקלות יחסית לרכישה, אך הן יכולות להיות מורכבות ויקרות. מנומטרים של עשה זאת בעצמך הם זולים, אך עלולים לגרום לטעויות ולדרוש ייצור עבור כל ניסוי. הרספירומטר הקולומטרי זול יחסית, קל לשימוש, מספק קריאה נוחה של פרמטרים סביבתיים, וכל הרכיבים ניתנים לשימוש חוזר.בנוסף, החלפה קבועה של חמצן שומרת על סביבה יציבה במשך שעות או אפילו ימים. במעבדה נחקור את השונות המטבולית בין זני בקרה מבוססים של דרוזופילה, ואת ההשפעות של מוטציות היפר והיפואקטיביות על צריכת חמצן. בשטח נתחיל לחקור את קצב חילוף החומרים והעמידות לטמפרטורה של חיפושיות בר מותאמות מדבר.

מדידת צריכת O₂ בדרוזופילה מלנוגסטר באמצעות מיקרו-רספירומטריה קולומטרית

Abstract